汪慧敏, 孫 淼, 屈 鋒(北京理工大學生命學院,北京 100081)

化妝品是重要的日化產(chǎn)品之一。隨著生活水平的提高,人們對化妝品的使用越來越頻繁,對其質(zhì)量要求也越來越高。小分子有機酸是化妝品的重要成分之一。它通過滲透至皮膚角質(zhì)層,使老化角質(zhì)層中的細胞鍵合力減弱,加快細胞更新速度,促進死亡細胞脫離,從而使皮膚表面光滑、細嫩、柔軟。小分子有機酸具有防皺、抗衰老的作用[1],但超量使用含有機酸類的化妝品,可能會減弱皮膚對紫外線的抵抗力,導致皮膚老化,發(fā)紅、起泡乃至灼傷,加速對皮膚細胞的破壞,造成對皮膚的永久性傷害[2-4]。世界各國對化妝品中的有機酸添加都有含量限定。我國對化妝品中有機酸的含量檢測是化妝品衛(wèi)生管理的一項重要指標,規(guī)定:α-羥基酸(酒石酸、乳酸、蘋果酸、乙醇酸、檸檬酸)含量不得大于6%(質(zhì)量分數(shù));防腐劑甲酸的最大允許量為0.5%(質(zhì)量分數(shù))[5]。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中有機酸的檢測方法有離子色譜法(IC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)。IC采用電導檢測,需要特殊的抑制器,且色譜柱昂貴、使用壽命短[6];HPLC在pH 2.45的條件下對較強極性的5種有機酸的保留及分離能力有限,與雜質(zhì)分離不好,檢測易受基體干擾[7];GC分析有機酸樣品需要進行15 min柱前衍生處理[8],衍生步驟繁瑣且重現(xiàn)性低。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中使用上述3種方法對化妝品中有機酸的檢測,分別需要11、13、18 min[5]。

毛細管電泳法(CE)分辨率高、分析速度快[9]、試劑用量少[10]、操作簡單[11,12],已經(jīng)應用于食品[13]、葡萄酒[14]、益生菌[15]、醋[16]、啤酒[17]、木材[18]、植物[19]、纖梭桿菌發(fā)酵液[20]、尿液[21]、中藥[22]中有機酸的檢測。Liu等[23]建立的毛細管電泳法可在10 min內(nèi)檢測美白亮膚凝膠、去角質(zhì)清潔劑中乳酸、蘋果酸、酒石酸、乙醇酸、檸檬酸、扁桃酸、水楊酸等7種有機酸。但該法需要使用環(huán)糊精修飾毛細管,操作較復雜,方法的重現(xiàn)性較低,如蘋果酸峰面積的RSD為8.21%,檸檬酸峰面積的RSD為6.48%。Dutra等[24]建立的毛細管電泳間接紫外檢測方法成功檢測出巴西圣保羅區(qū)市售5種化妝品中的酒石酸、乙醇酸、乳酸等3種有機酸。其他采用毛細管電泳法分析化妝品中有機酸的報道不多。

本文針對我國市售的水、乳、膏狀3類化妝品,建立了毛細管電泳間接紫外檢測方法?？稍? min內(nèi)完成甲酸、蘋果酸、檸檬酸、乙醇酸、乳酸5種常見有機酸的同時檢測。該方法不僅操作簡單、節(jié)省樣品,且比規(guī)范中所用3種色譜方法省時5～12 min,較報道的毛細管電泳法檢測化妝品中有機酸[23,24]用時更短,可同時檢測的有機酸種類更多,將該法用于水狀、乳狀、膏狀3種化妝品中有機酸的檢測,可滿足分析檢測需求,有望成為化妝品中有機酸色譜分析檢測方法的替代和補充。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7100型毛細管電泳儀(安捷倫科技公司)、KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、冷凍高速離心機(ThermoFisher Scientific公司)、高速振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)等。甲酸(純度≥99.0%)、蘋果酸(純度≥99.0%)、檸檬酸(純度≥99.0%)、乙醇酸(純度≥99.5%)、乳酸(純度≥99.0%),購于北京化工廠;鄰苯二甲酸氫鉀(純度≥99.8%,北京百靈威科技有限公司),十四烷基三甲基溴化銨(TTAB,純度≥99.5%,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司),超純水。

1.2 背景電解質(zhì)溶液和標準樣品的配制

毛細管電泳的背景吸收電解質(zhì)溶液為15 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀(含0.4 mmol/L TTAB)組成,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為5.6。所有電解質(zhì)溶液使用前用0.45 μm的濾膜過濾,常溫保存。

用超純水分別配制0.500 mol/L甲酸、蘋果酸、檸檬酸、乙醇酸,5.000 mol/L乳酸作為標準樣品的儲備液,于常溫保存。

1.3 毛細管電泳分析條件

毛細管電泳分離條件:熔融毛細管(有效長度/總長度:48.5 cm/57 cm,內(nèi)徑:75 μm);進樣壓力5 kPa;進樣時間5 s;分離電壓:-15 kV;檢測波長:254 nm;分離溫度:25 ℃。

新毛細管在使用前,分別用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH和H2O各沖洗30 min。兩次實驗進樣間用0.1 mol/L NaOH、H2O和背景電解質(zhì)溶液各沖洗3 min。更換背景電解質(zhì)溶液時,以0.1 mol/L NaOH溶液、H2O和背景電解質(zhì)溶液各沖洗5 min。毛細管不用時水封,于室溫下保存。

1.4 樣品前處理

實驗所用爽膚水、保濕乳、護手膏樣品購于北京某商場。稱取爽膚水樣品1.000 0 g于2 mL離心管中,加純水稀釋至2 mL后進樣;分別稱取1.000 0 g保濕乳和護手膏樣品于50 mL離心管中,加0.5 mL 20%(v/v)甲醇助溶。再用純水稀釋至50 mL,超聲30 min,于高速離心機上離心20 min(12 000 r/min),取上清液用于樣品分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細管電泳分析方法的建立

在CE模式中,有機酸作為陰離子,其電泳方向與電滲流方向相反,其遷移速率較慢,分離效率降低。為加快陰離子遷移速率,通常在溶液中加入陽離子表面活性劑TTAB作為電滲流改性劑[25]。因TTAB與毛細管管壁硅羥基產(chǎn)生靜電吸引作用,以及另側(cè)十四烷基疏水基團的疏水聚集作用,導致毛細管內(nèi)壁呈正電荷性,從而改變電滲流方向,使Zeta電勢為正[26]。因此,加入TTAB使電滲流反向,可加快有機酸陰離子的遷移速率,縮短有機酸檢測時間[16]。所測有機酸在220 nm以上沒有生色官能團[27],不能進行直接紫外檢測,故采用間接紫外檢測法。在電泳運行緩沖液中加入鄰苯二甲酸氫鉀,可提高背景吸收。當有機酸樣品遷移通過檢測窗口時,則背景信號減弱,呈現(xiàn)負峰,實現(xiàn)間接紫外檢測。與直接紫外檢測方法[28,29]相比,間接紫外檢測用時更短,靈敏度更高[9,10,30,31]。本文針對所購爽膚水、保濕乳、護手膏中的有機酸分析,建立和優(yōu)化了毛細管電泳間接紫外檢測方法。

2.1.1陽離子表面活性劑濃度的影響

在陰離子分析時,通常采用的TTAB濃度為0.2 mmol/L[31]、0.25 mmol/L[32]、0.3 mmol/L[33]、0.5 mmol/L[34,35]和0.75 mmol/L[36]。我們比較了3種TTAB濃度(0.2、0.4、0.6 mmol/L )對有機酸分離的影響,從圖1可以看出,當TTAB濃度為0.2 mmol/L和0.4 mmol/L時,5種有機酸均可實現(xiàn)完全的基線分離。但0.2 mmol/L時,乳酸(峰5)出峰后基線不平,似有干擾組分。當TTAB濃度為0.6 mmol/L時,未見蘋果酸峰(峰2),且檸檬酸和乙醇酸(峰3和峰4)出峰時間相近,分離度降低;因此,采用0.4 mmol/L TTAB,此時5種有機酸的分離度最高,各峰檢測無干擾,易于分析。

圖1 陽離子表面活性劑TTAB濃度對有機酸分離的影響Fig.1 Effect of TTAB cationic surfactant concentrationson the separation of organic acids TTAB:tetradecyltrimethylammonium bromide. Peaks:1.formic acid;2.malic acid;3.citric acid;4.glycolic acid;5.lactic acid.

圖2 背景電解質(zhì)溶液中鄰苯二甲酸氫鉀濃度對有機酸分離的影響Fig.2 Effect of concentration of potassium acid phthalate background electrolyte on the separation of organic acids Peaks 1-5 are the same as in Fig.1.

2.1.2背景電解質(zhì)濃度的影響

考察背景電解質(zhì)溶液中鄰苯二甲酸氫鉀的濃度(10、15、20 mmol/L)對有機酸分析檢測的影響。如圖2所示,使用10 mmol/L和20 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀時,5種有機酸難以檢測,也無法定量分析。使用15 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀時,5種有機酸可在5 min內(nèi)出峰,且分離度良好,基線較平穩(wěn)。

2.1.3背景電解質(zhì)pH的影響

毛細管電泳利用分析物的遷移率不同實現(xiàn)分離。遷移率的大小主要依賴于分析物的荷質(zhì)比。分析物在溶液中的帶電荷數(shù)由分析物的pKa和溶液的pH決定。理論上,pKa與pH差異越大,分析物的離子化程度越高,電荷數(shù)越多,遷移時間越快。本研究中,甲酸、乙醇酸、乳酸均為一元羧酸,其相對分子質(zhì)量相近,實際遷移順序與其pKa大小順序一致;而蘋果酸和檸檬酸為二元和三元羧酸,其相對分子質(zhì)量也明顯大于前3種有機酸,故實際遷移順序與其pKa大小順序不完全相符。5種有機酸的pKa值在3～6之間(甲酸:pKa=3.75;蘋果酸:pKa1=3.40,pKa2=5.11;檸檬酸:pKa1=3.14,pKa2=4.77,pKa3=5.40[33];乙醇酸:pKa=3.83;乳酸:pKa=3.86[25]),故緩沖溶液的pH也選在這一范圍內(nèi)?？疾炝藀H 4.0、5.0、5.6的背景電解質(zhì)溶液對5種有機酸同時分析的影響。如圖3所示,當pH為4.0和5.0時,檸檬酸峰(峰3)出現(xiàn)裂峰,且pH 4.0時乙醇酸峰(峰4)后基線不平,乳酸峰(峰5)出峰很小。而當pH為5.6時,5種有機酸均可實現(xiàn)基線分離。因此選擇pH 5.6的背景電解質(zhì)溶液進行后續(xù)實驗。

圖3 背景電解質(zhì)溶液pH對有機酸分離的影響Fig.3 Effect of background electrolyte solution pH on the separation of organic acids Peaks 1-5 are the same as in Fig.1.

表1 5種有機酸的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)及檢出限Table 1 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients (R2)and limits of detection(LODs)of the five organic acids

y:peak area;x:mass concentration,mg/L.

2.2 方法的線性范圍、線性方程和檢出限

在上述優(yōu)化條件下,以有機酸質(zhì)量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標進行線性擬合,5種有機酸的線性范圍、線性方程和相關系數(shù)見表1。不斷稀釋樣品溶液,至樣品溶液的信號強度為噪聲的3倍,將此時樣品溶液中有機酸的含量確認為檢出限,結(jié)果見表1。在《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中,甲酸的檢測方法是HPLC和GC。其中,HPLC的檢出限為1 μg/g,但未給出GC的檢出限。蘋果酸、檸檬酸、乙醇酸、乳酸4種有機酸使用的檢測方法是IC、HPLC和GC。其中,離子色譜的檢出限最低,4種有機酸的檢出限均在1.66～3.4 ng/g之間;HPLC次之,在0.2～0.4 μg/g之間;也未給出GC的檢出限。

本文方法測得的甲酸檢出限比《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中HPLC低,而蘋果酸、檸檬酸、乙醇酸、乳酸與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中HPLC的檢出限在同一數(shù)量級。本方法的檢出限可滿足《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的要求。

2.3 化妝品中有機酸的加標回收率和檢測精密度

取化妝品樣品溶液一份,均分成4份。1份用于直接測定,另外3份溶液中分別添加低(5種有機酸終濃度均為50 mg/L)、中(5種有機酸終濃度均為100 mg/L)、高(5種有機酸終濃度均為200 mg/L)3個水平的5種有機酸混合標準溶液,考察樣品檢測的回收率。每個水平的樣品平行測定3次,所得檢測結(jié)果見表2。在50、100、200 mg/L 3個加標水平下,樣品分析的回收率均在95.0%～101.6%之間,且RSD均在2.0%以內(nèi),驗證了方法良好的準確性和精密度。

表2 樣品中5種有機酸的加標回收率和精密度(n=5)Table 2 Recoveries and precisions of the five organic acids spiked in samples (n=5)

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2.4 供試樣品中5種有機酸含量的檢測

購買北京市場所售5種實際樣品,測得5種有機酸的含量見表3。檢測結(jié)果表明,市場所售A樣品中檸檬酸含量為0.02%;B樣品中乙醇酸含量為0.01%;C樣品中檸檬酸含量為0.02%,乳酸含量為0.17%;D樣品中乳酸含量為0.23%;E樣品中乳酸含量為0.18%。5種實際樣品中所測有機酸含量均低于6%,符合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)的相關要求。

表3 化妝品中5種有機酸的含量Table 3 Contents of the five organic acids in cosmetics

3 總結(jié)

本文發(fā)展了針對爽膚水、保濕乳和護手膏3類化妝品中有機酸分析的毛細管電泳間接紫外檢測方法。該法操作簡單、分析快速、無需使用有機試劑,可用于3類化妝品中5種常用有機酸的分析檢測,并有望用于化妝品生產(chǎn)和保存過程中的質(zhì)量監(jiān)測。