彭 婕, 甘金華,2, 居小倩, 陳建武, 何 力,2*(.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢),湖北 武漢 430223;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制實驗室,北京 004)

稻漁共作是近幾年興起的綠色、環(huán)境友好型水產(chǎn)品養(yǎng)殖模式,可實現(xiàn)種養(yǎng)共生互利,促進(jìn)農(nóng)民豐產(chǎn)增收,因此在中國得到廣泛應(yīng)用。與此同時,種稻過程中所用農(nóng)藥對稻田養(yǎng)殖水產(chǎn)品食用安全性的影響也受到一定程度的關(guān)注。毒死蜱作為一種高效的殺蟲劑在我國南方水稻種植區(qū)域廣泛使用。有報道[1,2]指出,毒死蜱對水生生物具有較高的毒性,毒死蜱中毒后可引起呼吸系統(tǒng)、心血管和腸道方面的疾病。最新研究顯示,暴露于毒死蜱的環(huán)境中可引起甲狀腺疾病、帕金森病等[3,4]。稻田水產(chǎn)品作為稻田環(huán)境中主要的生物類群,極易因富集效應(yīng)受到養(yǎng)殖環(huán)境中毒死蜱的影響,但關(guān)于稻田水產(chǎn)品農(nóng)藥殘留相關(guān)質(zhì)量安全問題卻鮮有研究。

毒死蜱的檢測方法主要包括氣相色譜法(GC)[5,6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8,9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[11-13]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與氣相色譜法和高效液相色譜法相比,具有抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點;同時它比氣相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。目前僅有采用氣相色譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中毒死蜱方法的報道,利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中毒死蜱的檢測方法未見報道。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對稻田養(yǎng)殖水產(chǎn)品(主要為鯉魚和克氏原螯蝦)中毒死蜱進(jìn)行定性定量分析。該方法簡便、快捷、靈敏度高,為稻田水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留監(jiān)控和質(zhì)量安全評價提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀、TSQ Quantiva三重四極桿-質(zhì)譜儀附加熱大氣壓電噴霧電離源和Trace Finder 3.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%,德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇(色譜純,德國Merck公司);乙腈、乙酸乙酯、甲酸和乙酸(色譜純,美國J.T.Baker公司);乙酸銨(色譜純,美國Fisher公司);無水硫酸鎂(MgSO4)(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA,40～60目)、石墨化炭黑(GCB,120～400目)(德國CNW公司);C18(40～60目,博納艾杰爾科技有限公司);實驗用水為Milli-Q高純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.1 mg),置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度線,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃冰箱中保存;用初始流動相溶液將其稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1樣品制備

鯉魚去鱗,帶皮沿背脊取肌肉部分;克氏原螯蝦去頭、殼、腸腺,取肌肉部分。試樣切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后均質(zhì)、混勻,密封,標(biāo)記,于-20 ℃冷凍保存,備用。

1.3.2提取

稱取(2.00±0.01)g解凍后的樣品,置于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻1 min,于室溫下超聲提取5 min,以7 000 r/min冷凍離心5 min,取上清液,置于25 mL比色管中,重復(fù)提取一次,合并上清液并定容至刻度線,混勻,備用。

1.3.3凈化

取10 mL上清液,置于15 mL具塞離心管中,依次加入0.2 g PSA和1.2 g MgSO4,渦旋振蕩1 min,以7 000 r/min冷凍離心5 min,取5 mL上清液,置于30 ℃氮吹儀吹至小于1 mL,再用乙腈定容至1 mL,渦旋、混勻,過0.22 μm尼龍濾膜,供UPLC-MS/MS檢測。

1.4 分析條件

色譜柱:Thermo Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),B為甲醇;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫條件:0～1.0 min,80%A;1.0～5.0 min,80%A～10%A;5.0～9.0 min,10%A;9.0～9.1 min,10%A～80%A;9.1～12.0 min,80%A。進(jìn)樣量:10 μL。

離子源:加熱大氣壓電噴霧電離源,正離子模式;掃描方式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式;噴霧電壓:3 500 V;蒸發(fā)溫度:350 ℃;離子傳輸毛細(xì)管溫度:330 ℃;鞘氣(高純氮氣)流速:30 L/min;輔助氣(高純氮氣)流速:5 L/min;監(jiān)測離子對:m/z350.0/198.0(定量離子)和350.0/97.0;碰撞壓力:20 V和30 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

查閱文獻(xiàn)[14,15]發(fā)現(xiàn),有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測定時流動相中水相多為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸),有機(jī)相則常用甲醇或乙腈。本實驗對比研究了有機(jī)相分別為甲醇和乙腈時,目標(biāo)物的響應(yīng)值和分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈時,毒死蜱響應(yīng)偏低,且色譜峰峰形較差;采用甲醇時,毒死蜱響應(yīng)值升高很多,色譜峰峰形得到明顯改善。

同時分別比較了柱溫為30 ℃和40 ℃、流速為0.2 mL/min和0.3 mL/min條件下毒死蜱的分離效果。當(dāng)色譜柱溫度為30 ℃時,毒死蜱在梯度條件重回起始比例時才出峰,出峰時間較晚且色譜峰較寬,而40 ℃的柱溫能夠讓毒死蜱出峰時間提前;對比流速為0.2 mL/min時毒死蜱的分離效果,當(dāng)流速提高至0.3 mL/min時,毒死蜱在高有機(jī)相時出峰,保留時間提前,且色譜峰較窄,峰形對稱。毒死蜱極性較弱,當(dāng)柱溫和流速更高時,更容易被洗脫出來,同時使用甲醇這種質(zhì)子性溶劑,有助于提高其響應(yīng)值。因此選擇甲醇作為有機(jī)相,柱溫選擇40 ℃，流速選擇0.3 mL/min。

圖1 毒死蜱子離子的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of product ions of chlorpyrifos

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要包括優(yōu)化化合物的母離子、子離子和碰撞能量等。取質(zhì)量濃度為1 mg/L的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蠕動泵將其隨流動相一同注入質(zhì)譜儀中,在正離子模式下儀器自動對目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn),化合物優(yōu)化時在水相中加入部分甲酸和乙酸銨,毒死蜱響應(yīng)值較高,靈敏度較好。優(yōu)化后毒死蜱子離子的質(zhì)譜圖見圖1,毒死蜱脫水后子離子的m/z為322.0，但不適合被選作定性或定量離子，其他響應(yīng)最強(qiáng)的兩個子離子的m/z為97.0和198.0。因此選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高的為定量子離子(m/z198.0),次高的為定性子離子(m/z97.0)。

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

有機(jī)磷類藥物多采用乙腈[5]、乙酸乙酯[8]、酸化乙腈[16]和酸化乙酸乙酯[17]作為提取溶劑。本實驗比較了乙腈、乙酸乙酯、含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和含1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯溶液作為提取劑時,鯉魚和克氏原螯蝦中毒死蜱的提取效率(見圖2)。結(jié)果表明,當(dāng)含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和含1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯溶液作為提取劑時,目標(biāo)物回收率偏低;采用乙酸乙酯提取目標(biāo)物時,回收率可達(dá)70%以上,但回收率不穩(wěn)定,平行樣之間偏差較大,同時乙酸乙酯能夠溶解水產(chǎn)品中大量脂肪,給后續(xù)凈化增加困難;采用乙腈作為提取溶劑時,得到的色譜圖峰形較好,且毒死蜱回收率高,能夠滿足分析要求。因此最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 采用不同提取溶劑時鯉魚和克氏原螯蝦中毒死蜱的回收率(n=3)Fig.2 Recoveries of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii by the different extraction solvents (n=3)

2.3.2吸附劑種類和用量的選擇

水產(chǎn)品中含有大量脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),如何去除成為凈化的關(guān)鍵步驟。QuEChERS方法能夠快速高效地去除水產(chǎn)品中的各類雜質(zhì),常用的吸附劑種類有PSA、C18、GCB和MgSO4。PSA通過氫鍵和化合物作用,可除去水產(chǎn)品中的脂肪酸和色素等物質(zhì)。C18吸附劑常被作為QuEChERS方法的凈化劑,它對非極性物質(zhì)有較高的容量,因此對水產(chǎn)品中油脂的去除效果顯著。C18和PSA混合使用能夠有效去除強(qiáng)極性至弱極性的基質(zhì)干擾物[18]。GCB則對色素有明顯吸附作用。由于乙腈與水互溶,凈化時加入MgSO4能夠吸附提取劑中的水分,保證濃縮時的回收率。

實驗比較了PSA(0.2 g)、C18(0～0.2 g)、GCB(0～0.2 g)和MgSO4(0.6～1.2 g)不同用量不同組合時對目標(biāo)化合物回收率的影響(見表1)。對毒死蜱加標(biāo)量為10 μg/kg的鯉魚和克氏原螯蝦進(jìn)行分析,當(dāng)凈化試劑中加入C18或GCB時,毒死蜱回收率相對較低。當(dāng)PSA采用0.2 g時，對比MgSO4分別選用0.6、0.9和1.2 g時毒死蜱的加標(biāo)回收率,結(jié)果表明，采用1.2 g MgSO4時,毒死蜱的回收率最高,故選為所用。

表1 采用不同吸附劑時鯉魚和克氏原螯蝦中毒死蜱的回收率(n=3)Table 1 Recoveries of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii by the different absorbents (n=3)

PSA:primary secondary amine;GCB:graphitized carbon black.

2.3.3氮吹溫度的選擇

前處理中不同氮吹溫度會對毒死蜱的回收率產(chǎn)生不同影響,因此選擇適宜的氮吹溫度也很重要。實驗表明,當(dāng)?shù)禍囟雀哂?5 ℃時,毒死蜱的回收率較低;當(dāng)溫度低于25 ℃時,蒸發(fā)速度過慢,延長了前處理時間;當(dāng)溫度為30 ℃時,既獲得了良好的加標(biāo)回收率,又縮短了氮吹時間(見圖3)。因此本實驗選擇30 ℃為最佳氮吹溫度。

圖3 采用不同氮吹溫度時鯉魚和克氏原螯蝦中毒死蜱的回收率(n=3)Fig.3 Recoveries of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii by different nitrogen blowing temperatures (n=3)

2.3.4溶解液的選擇

實驗比較了乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇(8∶2,v/v)、5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇(2∶8,v/v)3種溶解液對目標(biāo)物的溶解效率。結(jié)果顯示,當(dāng)溶解液為5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)-甲醇(8∶2,v/v)時,毒死蜱的溶解效率<5%,絕大多數(shù)毒死蜱在此步驟損失;另外兩種溶解液溶解殘渣后,毒死蜱色譜峰峰形均很好,但因毒死蜱極性較弱,溶解液中水相比例越大,對目標(biāo)化合物的溶解效率越低,因此選用乙腈作為溶解液。

2.4 方法評價

2.4.1線性范圍、檢出限及定量限

按1.3節(jié)方法分別對空白鯉魚和克氏原螯蝦樣品進(jìn)行前處理,得到鯉魚和克氏原螯蝦空白樣品提取液,用提取液配制毒死蜱系列(0.5、2、5、10、20、50和100 μg/L)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液,在最優(yōu)的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定,采用外標(biāo)法定量,以毒死蜱的質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標(biāo)、定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。毒死蜱在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,鯉魚基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=88 729X+137 896,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 1,克氏原螯蝦基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=94 115X-1 512.2,R2為0.999 9。

在空白鯉魚和克氏原螯蝦樣品中添加一定含量的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過提取凈化后上機(jī)測定,以不小于3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分別確定毒死蜱的檢出限和定量限，分別為0.25 μg/kg和0.5 μg/kg。目前報道的水產(chǎn)品中毒死蜱檢出限為0.5 μg/kg[10]和1.0 μg/kg[9],均高于本方法,說明本方法能夠滿足殘留分析的要求。

2.4.2回收率和精密度

按1.3節(jié)描述進(jìn)行前處理,向鯉魚和克氏原螯蝦樣品中分別添加低、中、高(2.0、5.0、10.0 μg/kg)3個水平的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個添加水平做6個平行樣品,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。結(jié)果表明,鯉魚中毒死蜱回收率為86.2%～102.9%,RSD為3.5%～7.6%;克氏原螯蝦中毒死蜱回收率為98.6%～103.6%,RSD為4.1%～6.9%(見表2)。

表2 鯉魚和克氏原螯蝦中毒死蜱的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of chlorpyrifos in crap and Procambarus clarkii (n=6)

2.4.3基質(zhì)效應(yīng)(ME)

按1.2節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為Y=116 420X-56 748,R2為0.999 1,鯉魚和克氏原螯蝦基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線見2.4.1節(jié)。采用公式ME=[1-(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)]×100%,考察方法的基質(zhì)效應(yīng)[19]。如果ME值為負(fù)值,表明基質(zhì)對信號有增強(qiáng)作用;如果ME值為正值,則基質(zhì)對信號有抑制作用。結(jié)果表明,鯉魚的ME值為23.7%,克氏原螯蝦的ME值為19.2%,均大于15%,說明兩種水產(chǎn)品基質(zhì)對毒死蜱的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度均呈輕微抑制作用,因此選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計算。

2.5 實際樣品的測定

按照該方法檢測21份稻田養(yǎng)殖鯉魚和62份稻田養(yǎng)殖克氏原螯蝦,其中5份鯉魚中檢出毒死蜱殘留,含量范圍為8.95～43.68 μg/kg,檢出率為23.8%。毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)、空白鯉魚樣品和陽性鯉魚樣品的總離子流色譜圖見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白鯉魚和陽性鯉魚樣品中毒死蜱的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatograms of chlorpyrifos in a standard solution,a blank crap sample and a positive crap sample

3 結(jié)論

本文通過前處理條件和色譜條件的優(yōu)化,建立了檢測稻田水產(chǎn)品中毒死蜱殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法操作簡便,回收率高,重復(fù)性好,為稻田水產(chǎn)品中毒死蜱殘留的風(fēng)險監(jiān)測、風(fēng)險評估等提供了高效可靠的分析手段。