韓 易,趙 燕,徐明生,姚 瑤,吳 娜,杜華英,涂勇剛,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045; 2.南昌大學(xué),生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心,江西南昌 330047)

美拉德反應(yīng)是由法國(guó)生物化學(xué)家美拉德于1912年發(fā)現(xiàn)的一種非酶褐變反應(yīng),又稱羰氨反應(yīng)。在此反應(yīng)中,羰基化合物(還原糖類)與氨基化合物(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、胺等)經(jīng)過(guò)縮合、聚合后最終生成一類棕褐色、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、聚合度不等的高分子聚合物混合物,稱之為類黑精[1]。美拉德反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜,其終產(chǎn)物類黑精結(jié)構(gòu)也極其復(fù)雜,并具有多種功能活性。

類黑精廣泛地存在于各類食品中,如蜂蜜、食醋、醬油、咖啡、烤面包、皮蛋、豆豉和醬油等,是食品色澤和風(fēng)味的主要來(lái)源,同時(shí)具有一定的功能活性。因此,自發(fā)現(xiàn)以來(lái),類黑精成為食品學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、香料化學(xué)、毒理學(xué)以及中藥學(xué)研究中經(jīng)久不衰的研究課題?；陬惡诰谑称分械闹匾?本文對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精的制備、分離純化、理化特性與結(jié)構(gòu)表征以及功能活性展開綜述,以期為食品類黑精的相關(guān)研究及應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 類黑精的形成

類黑精的形成經(jīng)歷了美拉德反應(yīng)的三個(gè)階段,分別為初期階段、中期階段與末期階段。其每一個(gè)階段包括若干反應(yīng)。初期階段發(fā)生了羰氨縮合與分子重排兩種作用,生成了Schiff堿與單果糖胺及酮糖基胺等異構(gòu)體;中期階段果糖基胺脫水生成羥甲基糠醛,果糖基胺脫去胺殘基重排生成還原酮,同時(shí)伴有Strecker降解產(chǎn)生二氧化碳,果糖基胺還會(huì)生成其他雜環(huán)化合物如吡咯,呋喃吡喃化合物等;末期階段多羰基不飽和化合物一方面進(jìn)行裂解反應(yīng),另一方面進(jìn)行縮合聚合反應(yīng),如醇醛縮合生成不飽和醛,或是前階段產(chǎn)物中的糠醛及其衍生物、二羰基化合物、還原酮類和裂解的醛等物質(zhì),經(jīng)過(guò)進(jìn)一步縮合聚合形成復(fù)雜的高分子色素類黑精。類黑精具體形成的過(guò)程如圖1所示,其是以葡萄糖做糖源為例的美拉德反應(yīng)生成類黑精的具體路線。

圖1 美拉德反應(yīng)形成類黑精的路線圖Fig.1 Reaction route for the formation of melanoidins in Maillard reaction

2 類黑精的來(lái)源與制備

類黑精廣泛存在于食品中,早餐谷類食品中類黑精含量較高達(dá)到25.5%,餅干達(dá)到20.2%;同種食品不同部位類黑精含量也不盡相同,面包皮中類黑精含量高達(dá)14.0%,而整個(gè)面包中其含量低至4.4%,同類食品不同特性情況下類黑精含量也有所差別,咖啡類黑精含量為5.7%±2.3%,而速溶咖啡其含量稍高一些,為9.1%±3.7%,可能速溶咖啡中的類黑精溶解量更大,液態(tài)食品例如淺色啤酒也含有類黑精達(dá)8.7%[2]。類黑精也可以通過(guò)不同氨基酸與還原糖制備獲得。由于類黑精形成過(guò)程復(fù)雜,目前使用單一氨基酸及還原糖模型制備類黑精的研究較多。Mondaca-Navarro等[3]分別使用半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、果糖、葡萄糖為原料,其中氨基酸與葡萄糖按照1∶1 (v/v)的比例在不同溫度、不同時(shí)間下進(jìn)行美拉德反應(yīng),測(cè)定了獲得的不同種模型的類黑精抗氧化性以及金屬離子螯合作用。Vhangani等[4]使用核糖、果糖、甘氨酸、賴氨酸為美拉德反應(yīng)原料制備了類黑精,并測(cè)定了其抗氧化性能?？傊?使用單一氨基酸與單一還原糖造模進(jìn)行美拉德反應(yīng),形成類黑精結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,性質(zhì)較為穩(wěn)定,更適合后續(xù)研究,是目前開展此類研究的熱點(diǎn)。

3 類黑精提取及分離純化方法

3.1 類黑精的提取

提取類黑精的主要方法為溶劑提取法,所選用提取劑大多為水或不同濃度的乙醇水溶液。秦禮康[5]在粗提豆豉類黑精過(guò)程中,用不同濃度的乙醇水溶液對(duì)樣品進(jìn)行振蕩溶解,以吸光值作為衡量指標(biāo),優(yōu)化出最佳提取劑的料液比為1∶10。蔣家奎[6]采用不同濃度乙醇水溶液多次浸提鎮(zhèn)江香醋炒米,從中提取類黑精。雖然操作簡(jiǎn)單,但是此種溶劑提取方法只能提取水溶性或醇溶性類黑精,被提取的類黑精種類并不全面,會(huì)對(duì)類黑精之后的分離純化、結(jié)構(gòu)分析、理化性質(zhì)研究及生物活性機(jī)理等的開展帶來(lái)一定影響。

3.2 類黑精的分離純化

目前應(yīng)用的類黑精分離純化方法有凝膠柱層析法、超濾法、透析法、硅膠柱層析法、大孔樹脂分離法和高效液相色譜法,其應(yīng)用對(duì)象與優(yōu)缺點(diǎn)見表1。雖然上述方法在類黑精分離上得到較好應(yīng)用,但由于食品中類黑精的組成復(fù)雜多樣,同時(shí)其作為一類隨時(shí)間和溫度不斷縮合和裂解的物質(zhì),類黑精的單體分離純化具有難度,類黑精單體難以獲得較好的分離純化,經(jīng)過(guò)分離純化后得到不同分離組分的類黑精成為了目前的研究熱點(diǎn)。

表1 類黑精分離純化方法的對(duì)比Table 1 Comparisons between separation and purification methods of melanoidin

4 類黑精的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

類黑精是一類高分子量聚合物,較難從食物中分離得到其單體,因此對(duì)其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)研究并不是十分詳盡。但通過(guò)類黑精美拉德反應(yīng)模型反應(yīng)體系研究,得出了類黑精的部分共同理化特性與結(jié)構(gòu)特征。

4.1 溶解性

類黑精具有較好的溶解特性,原因可能是發(fā)生美拉德反應(yīng)后蛋白間二硫鍵的鏈接和異構(gòu)肽之間的交聯(lián)、及蛋白分子與親水的糖基的鏈接等因素降低了蛋白質(zhì)相互作用,從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的溶解性。Saeki等[16]發(fā)現(xiàn)魚肌纖維蛋白與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后,溶解性有所提高;而Katamama等[17]選用扇貝肌纖維蛋白與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng),同樣反應(yīng)物具有良好的溶解特性;Shepherd等[18]發(fā)現(xiàn)酪蛋白-麥芽糊精的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精在低于pH6.0條件下均具有很好的溶解性,而未發(fā)生美拉德反應(yīng)的對(duì)照組在pH4.8以下幾乎不溶。此外,Groubet等[19]通過(guò)對(duì)β酪蛋白在厭氧條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn),在缺少氧氣的條件下,反應(yīng)產(chǎn)物類黑精溶解性提高并不明顯,原因是在美拉德反應(yīng)初期階段分子重排過(guò)程中形成的Amadori化合物很少,而導(dǎo)致反應(yīng)末期的蛋白質(zhì)交聯(lián),使最終生成類黑精的速率較低[20]?？傊?經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)后生成類黑精產(chǎn)物的溶解性與反應(yīng)前相比有所提高。

4.2 熱穩(wěn)定性

類黑精具有較好的穩(wěn)定特性。Shu等[21]研究了天然溶菌酶及其經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)修飾后的熱穩(wěn)定性,結(jié)果表明隨著溫度的升高,天然溶菌酶的濁度逐漸增加,在85 ℃下有所轉(zhuǎn)變,在95 ℃下達(dá)到了最大的濁度,而溶菌酶-半乳甘露聚糖類黑精,即使在95 ℃下也未出現(xiàn)聚集,這說(shuō)明溶菌酶通過(guò)半乳甘露聚糖的美拉德修飾轉(zhuǎn)化為受熱穩(wěn)定的形式。因此,多糖的鏈接可能引起蛋白形成受熱穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

4.3 光譜特性

4.3.1 紫外光譜特性 類黑精在紫外光譜中有特殊吸收峰,其大多表示為芳香族氨基酸吸收峰。Jiang等[22]對(duì)乳清蛋白-核糖類黑精紫外光譜研究顯示,類黑精在214～220 nm和275～278 nm處有吸收峰,前者特征峰主要表征肽鍵的變化,后者主要由類黑精生成過(guò)程中的生色團(tuán)結(jié)構(gòu)如呋喃、吡喃、吡咯等化合物形成引起。另外在220和280 nm處最大吸收峰也表明薜夫堿(-RC=N-)的形成[23]。

4.3.2 紅外光譜特性 傅里葉紅外光譜是研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精的有效手段。Sun等[24]研究了羧甲基纖維素(CMC)和大豆分離蛋白(SPI)發(fā)生美拉德反應(yīng)過(guò)程中1700～1400 cm-1處紅外光譜吸收峰的變化,結(jié)果表明酰胺I帶的C=O伸縮振動(dòng)(1680～1630 cm-1)和N-H彎曲振動(dòng)(1655～1590 cm-1)吸收強(qiáng)度略有減弱,這種減少是由美拉德反應(yīng)中羰基、氨基含量減少逐漸聚合形成大分子物質(zhì)產(chǎn)生的,但由于美拉德反應(yīng)初級(jí)產(chǎn)物Amadori化合物,薛夫堿及吡嗪的形成,會(huì)在此處有一定吸收,所以造成該處吸收峰變化不明顯。酰胺III帶(1450～1240 cm-1)這一區(qū)間主要來(lái)自于C-N的伸縮和N-H的變化。Rhim等[25]研究表明，酰胺III帶的變化是由于芳香族結(jié)構(gòu)中C-H向平面外彎曲而產(chǎn)生的。上述紅外光譜現(xiàn)象表明生成類黑精會(huì)導(dǎo)致蛋白光譜中基團(tuán)吸收發(fā)生變化,因此可以推測(cè)出具有代表性的類黑精基團(tuán),為類黑精復(fù)雜結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)研究。

4.3.3 熒光光譜特性 類黑精在激發(fā)波長(zhǎng)340～370 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為420～440 nm下具有典型的熒光波普特征,并且與未發(fā)生美拉德反應(yīng)的物質(zhì)對(duì)比,在420～440 nm處有新峰生成[26]。Baisier等[27]認(rèn)為這些熒光物質(zhì)主要來(lái)源于生成類黑精過(guò)程中氨基化合物的Strecker降解,或由中間產(chǎn)物中活性還原性化合物的進(jìn)一步反應(yīng)形成。

4.4 高分子量物質(zhì)

類黑精是含氮的高分子量物質(zhì)[28],其組分中同時(shí)也含有少量低分子物質(zhì)[29]。高分子量的類黑精顏色比低分子量深。Brudzynski等[30]研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜隨著溫度的增加褐變度增加,主要?dú)w因于高分子量的黑色素存在?？Х戎?9%組分為高分子類黑精(>12～14 kDa),并且高分子組分的生成主要是因?yàn)榭Х乳L(zhǎng)時(shí)間焙燒的原因,并且其顯示出比低分子組分的類黑精更強(qiáng)烈的棕色色感[31]。對(duì)于美拉德模型反應(yīng)生成類黑精的分子量也有相關(guān)研究,在天冬酰胺-葡萄糖模型系統(tǒng)中反應(yīng)加熱超過(guò)24 h所產(chǎn)生的類黑精分子量大部分大于10 kDa[32]。由此可見,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物顏色的形成主要來(lái)自于高分子量類黑精。

4.5 負(fù)電性結(jié)構(gòu)

雖然類黑精化學(xué)組成多種多樣,但研究表明類黑精均以負(fù)電荷的形式存在于食品或者是美拉德反應(yīng)模型體系中?？Х戎蓄惡诰且环N聚合高分子陰離子物質(zhì)[33],在咖啡類黑精中高分子量類黑精比低分子量類黑精帶有更多的負(fù)電荷。由模型反應(yīng)制備的類黑精同樣具有負(fù)電荷性質(zhì)。Kwak等[34]使用毛細(xì)管電泳技術(shù)將葡萄糖和賴氨酸反應(yīng)生成的類黑精進(jìn)行分離分析,結(jié)果表明其等電點(diǎn)的范圍是3.5～4.85,說(shuō)明在偏酸性的條件下,此模型中類黑精解離的正、負(fù)離子的趨勢(shì)和程度相同,所以在水溶情況下pH為中性時(shí)其帶有負(fù)電荷性質(zhì)。因此,食物中提取的類黑精以及模型制造的類黑精都具有負(fù)電性的結(jié)構(gòu)特征。

4.6 單元結(jié)構(gòu)特征

由此可見,類黑精復(fù)雜結(jié)構(gòu)目前尚無(wú)定論,但研究表明類黑精的結(jié)構(gòu)主要包括重復(fù)單元的吡咯或呋喃組成的聚合物等,通過(guò)縮聚反應(yīng)最終形成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。同時(shí),類黑精根據(jù)分子量可分為兩部分[39]，一類是低分子量有色物質(zhì),分子量小于1 kDa,另一類是高分子量有色物質(zhì),分子量大于1 kDa,有些高達(dá)100 kDa,這些高分子量物質(zhì)是由低分子量的生色團(tuán)通過(guò)氨基酸的氨基與蛋白質(zhì)交聯(lián)而形成的。類黑精也可能主要是由美拉德反應(yīng)第一階段的降解產(chǎn)物通過(guò)縮合聚合而形成的物質(zhì),糖分骨架占有大部分,氨基酸側(cè)鏈可能是后連上的。

5 生物活性

類黑精已被證實(shí)具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降糖、降血壓等多種生物活性,表2列舉了來(lái)自各類食物及模型的類黑精所具有的生物學(xué)功能。

表2 各類食物及模型體系中類黑精的生物學(xué)功能Table 2 Biological activities of melanoidins from various food and model systems

5.1 抗氧化作用

食品中提取的類黑精或由美拉德反應(yīng)模型體系產(chǎn)生的類黑精在體內(nèi)、體外均具有較好的抗氧化作用。食醋類黑精[8]在不同的抗氧化體系(DPPH自由基體系、超氧陰離子自由體系、羥自由基的體系、還原力)中均表現(xiàn)出抗氧化性。闞建全等[7]通過(guò)對(duì)豆豉類黑精測(cè)定過(guò)氧化值與紫外光解值證明其同時(shí)具有消除羥自由基,抗氧化和抑制N-二甲基亞硝胺的合成作用,其中對(duì)羥自由基消除能力高達(dá)95.79%,1%的豆豉類黑精的抗氧化能力相當(dāng)于0.2% BHT,在pH4時(shí)對(duì)抑制亞硝胺合成具有很強(qiáng)的作用,表明豆豉類黑精在模擬胃液的情況下抑制其生成。有研究者認(rèn)為類黑精具有抗氧化性是因?yàn)槠渚哂薪饘衮夏芰40],類黑精的負(fù)電荷性質(zhì)使得其能夠螯合過(guò)渡金屬。另外,類黑精的強(qiáng)抗氧化性可能是因?yàn)橛擅览路磻?yīng)產(chǎn)生的低分子量類黑精化合物具有較好的自由基清除能力[41]。此外,研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫和ABTS自由基的清除能力和類黑精顏色有具有良好的線性相關(guān)性[7]。面包提取物中非酚醛類成分的清除自由基能力隨烘烤時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,醋類黑精清除羥自由基的活性在蒸煮、儲(chǔ)藏和老化階段逐漸增加[8]。食品和模擬體系中類黑精生成量逐漸增加,同時(shí)抗氧化性也隨之增加,說(shuō)明類黑精的抗氧化能力與其顏色反應(yīng)程度呈正相關(guān)性。雖然類黑精是被公認(rèn)的抗氧化劑,但是對(duì)其抗氧化機(jī)理的研究還有待進(jìn)一步探索。

5.2 抗腫瘤作用

類黑精對(duì)肺癌、腸癌胃癌等均有一定抑制作用。Langner等[42]研究表明熱加工后的馬鈴薯類黑精提取物可防止肺癌細(xì)胞增殖,而且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性作用,具有潛在的飲食癌癥預(yù)防劑應(yīng)用前景。類黑精可以抑制人腸道癌細(xì)胞增殖,推測(cè)可能是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)受到類黑精抑制,使腸道癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞微管組織受影響而引起細(xì)胞凋亡[43]。Kamei等[44]發(fā)現(xiàn)從日本豆面醬和醬油中提取分離出的類黑精可以抑制DNA的合成與分化過(guò)程,從而證明其可以有效抑制體外結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)。類黑精體外抗腫瘤特性的研究較多,需要進(jìn)一步深入研究其體內(nèi)抗腫瘤效果與作用機(jī)制。

5.3 抗菌與抗炎作用

反應(yīng)模型制備的類黑精與食品中提取的類黑精均具有較好抗菌特性[45]。研究表明類黑精具有螯合性,可以捕獲陽(yáng)離子,縮短或消除致病性菌的生長(zhǎng)與繁殖[46],對(duì)慢性胃病發(fā)生發(fā)展中的幽門螺桿菌也具有抑制作用[47]。Marko等[48]表明與經(jīng)常用于治療傳染病的抗生素(阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南和左旋氟沙星)相比,美拉德反應(yīng)初始階段產(chǎn)物Schiff堿環(huán)化后的氮代葡萄糖基胺以及終產(chǎn)物類黑精中部分的氨基還原酮,不僅顯示出較高的抑制微生物作用,并可與上述抗生素產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。類黑精的抑菌活性不僅僅作用于胃腸道,Daglia等[49]研究表明咖啡經(jīng)過(guò)焙烤之后產(chǎn)生的活性物質(zhì),可以吸附到主體牙齒表面,防止牙齒受體與變異鏈球菌粘附,從而防止齲齒。

除抗菌活性外,類黑精也可同時(shí)具有較好的抗炎作用。Helou等[50]研究了面包外殼棕色美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在人類腸道中的作用,結(jié)果表明面包類黑精對(duì)于人胃腸道腸桿菌具有抑制作用,微生物群對(duì)其有反依賴性;而且,面包類黑精通過(guò)抑制腸桿菌而呈現(xiàn)一定抗炎功效。Vitaglione等[51]認(rèn)為咖啡類黑精可調(diào)節(jié)肝臟炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá),從而起到保護(hù)由高脂肪飲食引起肝臟損傷的作用。

5.4 降血壓作用

食品中類黑精基本骨架中氨基分支里含有糖降解產(chǎn)物,他們對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)具有一定抑制作用[52]。經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)咖啡中類黑精具有抑制ACE的作用,具有降血壓的功效,抑制活性位點(diǎn)可能位于類黑精結(jié)構(gòu)中,但也部分歸因于非化學(xué)結(jié)合在類黑精結(jié)構(gòu)上的低分子量化合物,即類黑精可作為血壓保護(hù)劑的載體[53]。五明紀(jì)春等[10]發(fā)現(xiàn)醬油類黑精對(duì)ACE具有較好抑制作用,促使血管緊張素Ⅱ生成及緩激肽降解減少,血管擴(kuò)張,血壓降低。但是類黑精抑制ACE的作用機(jī)制尚不明確,推測(cè)部分低分子量成分的類黑精可作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,從而競(jìng)爭(zhēng)底物酶的活性中心。

類黑精生物活性種類多樣,但是各種活性的機(jī)理尚不明確,對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步摸索探究,其構(gòu)效關(guān)系還不清楚,活性機(jī)制與功效關(guān)系研究薄弱嚴(yán)重限制了類黑精的開發(fā)應(yīng)用。

6 展望

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精,不但對(duì)食品色澤和風(fēng)味品質(zhì)有重大影響,而且具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降糖等多種生物活性功效,是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)、食品化學(xué)領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一,具有成為新型功能食品的潛力,但到目前為止,關(guān)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精的具體組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等仍不十分清楚,且其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究,現(xiàn)提出以下展望:

建立類黑精高效的分離純化方法。目前,類黑精分離純化的方法有限,主要采用透析、超濾、層析、色譜或毛細(xì)管電泳等方法進(jìn)行分離純化。此分離策略操作條件復(fù)雜、效率低、成本高,并且難以獲得類黑精單體。因此,有必要建立高效的類黑精分離純化方式,這是對(duì)其結(jié)構(gòu)與構(gòu)效關(guān)系的關(guān)鍵。

闡明類黑精結(jié)構(gòu)及其生物活性機(jī)制。類黑精結(jié)構(gòu)研究較為單薄,僅有獲得的類黑精單元結(jié)構(gòu)信息，但也屬理論推論。因此,在有效分離類黑精的基礎(chǔ)上,應(yīng)借助各種現(xiàn)代高分子儀器分析手段,闡明其精細(xì)結(jié)構(gòu)。同時(shí),從體內(nèi)外系統(tǒng)研究其活性機(jī)制,探明其構(gòu)效關(guān)系,為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

進(jìn)一步開發(fā)利用類黑精產(chǎn)品。雖然已證實(shí)類黑精具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗菌、抗炎等多種生理活性,但目前市場(chǎng)上并未見其相關(guān)功能性食品。因此,有必要開發(fā)不同類型的類黑精產(chǎn)品,使其成為一種新型功能食品或者食品添加劑替代品,從而為人類健康起到一定積極作用。