程志華,龔 霄,劉洋洋,趙鈺瑩,周 偉,彭 政

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070; 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實驗室,廣東湛江 524001; 3.海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實驗室,廣東湛江 524001; 4.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

番荔枝(AnnonasquamosaL.),又稱釋迦、洋波羅、佛頭果,是“世界五大熱帶名果”之一,廣泛種植于熱帶亞熱帶地區(qū),現(xiàn)我國海南、廣東、廣西、福建等熱區(qū)廣泛種植[1-2],主要栽培品種有圓滑番荔枝、刺果番荔枝、阿蒂莫耶番荔枝等,其中,以廣東的“林檎”最負(fù)盛名[3-4]。番荔枝果實果肉鮮嫩、營養(yǎng)豐富,含有豐富的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等,且果實中萜類、番荔枝內(nèi)酯、生物堿等生物活性物質(zhì),具有很好的抗氧化和抗腫瘤活性[5]。

番荔枝是典型的呼吸躍變型果實,在后熟過程中有明顯的呼吸高峰,后熟期極短,采后易受機(jī)械損傷和病毒侵害,極易腐爛變質(zhì),影響著番荔枝的食品品質(zhì)和商品價值[6]。陳蔚輝等[7]研究發(fā)現(xiàn)番荔枝果實采后在自然室溫(26～33 ℃)條件下貯藏壽命僅為3 d。溫度是熱帶亞熱帶園藝產(chǎn)品貯藏保鮮決定性的影響因素之一,與化學(xué)(SO2)或生物保鮮劑、氣調(diào)保鮮相比,低溫貯藏是維持采后果實品質(zhì)最安全、最有效的方法之一,在一定時間內(nèi)可以有效地抑制采后果實的呼吸代謝,顯著減少營養(yǎng)成分的流失[8-9]。楊敏等[10]研究不同貯藏溫度(30、4 ℃)對山竹果皮木質(zhì)化效應(yīng),低溫處理顯著抑制木質(zhì)素含量的增加,保持較低的呼吸強(qiáng)度,延緩了木質(zhì)化現(xiàn)象和果肉腐爛。劉娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)4 ℃貯藏能延緩鮮切火龍果營養(yǎng)成分的下降,保持較好的感官品質(zhì),延長貯藏期。Maldonado[12]等研究發(fā)現(xiàn)番荔枝果實采后易出現(xiàn)組織木質(zhì)化,木質(zhì)素積累,伴隨質(zhì)地糙硬少汁、內(nèi)部組織褐變等一系列劣變現(xiàn)象的發(fā)生。目前,國內(nèi)外對不同貯藏溫度下番荔枝采后的生理、貯藏品質(zhì)的研究很少,相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制和調(diào)控途徑仍沒有闡明,限制了番荔枝果實的市場拓展。本實驗以番荔枝為原材料,主要探討常溫(25 ℃)和低溫(4 ℃)處理對采后番荔枝呼吸速率、營養(yǎng)品質(zhì)、木質(zhì)素和總酚含量的影響,采用掃描電鏡和透射電鏡對貯藏前后番荔枝的微觀結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察解析,為采后番荔枝貯藏保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番荔枝 品種‘非洲驕傲’,采摘于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所果園,用泡沫網(wǎng)罩單獨(dú)包裝,整齊排列,于保溫箱內(nèi)低溫保存,1 h內(nèi)運(yùn)回實驗室;無水乙醇、牛血清蛋白、正己烷、冰醋酸、羥胺鹽酸、氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán) 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SY-1022果蔬呼吸測定儀 遼寧賽亞斯科技有限公司;UV-1780型紫外可見分光光度計 日本Shimadzu公司;3-30K型低溫高速離心機(jī) 德國Sigma公司;GY-4果實硬度計 智取精密儀器有限公司;TP-214電子天平 北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;保鮮盒 上海樂扣樂扣貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 選擇大小一致,成熟度一致,無病蟲害,無機(jī)械損傷的番荔枝果實,其果皮呈黃綠色,外觀為白粉。將果實隨機(jī)分成2組,每組3個平行,每個平行30個果實,放入保鮮盒(26 cm×18 cm×13.5 cm)中,分別置于溫度4、25 ℃,濕度80%下貯藏,每天從各處理平行3個組中隨機(jī)取出3個果實,去皮取樣,并用液氮速凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取樣部位為靠近果皮部分的果肉?/p>

式中:W1-貯藏前重量,W2-貯藏后重量。

1.2.3 硬度的測定 采用GY-4型果實硬度計測定。隨機(jī)選取3個果實,去皮,于果實最大橫徑處,將探針垂直指向平面,均勻施加壓力至刻度線,讀取數(shù)值,單果重復(fù)10次。結(jié)果以N表示。

1.2.4 掃描電鏡和透射電鏡觀察 掃描電鏡(SEM):參考Fundo等[13]的方法,取1 mm3的果肉,真空冷凍干燥24 h后,固定于觀察臺,然后采用離子濺射鍍金,再置于掃描電子顯微鏡下觀察并分析。

透射電鏡(TEM):參考Deng[14]等的方法,并稍加修改。取1 mm3的果肉,固定于2.5%戊二醛溶液,用磷酸鹽緩沖液洗滌,再用OsO4固定后進(jìn)行觀察。

1.2.5 可溶性固形物含量的測定 可溶性固形物(total soluble solid,TSS)含量采用手持折光儀測定。取1～2滴蒸餾水,滴于糖度計樣品臺,調(diào)零。取適量果肉,用紗布包裹,擠壓1～2滴果汁于樣品臺進(jìn)行測定。

1.2.6 可溶性蛋白含量的測定 參考曹建康[15]方法,并稍加修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取6支具塞試管,編號,分別加入100 μL/mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,再對應(yīng)加入蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL,混勻后向各試管中加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合,靜置2 min后,以0號試管為空白對照,在595 nm處比色測定吸光值。以蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程:y=0.007x+0.0903,R2=0.999。

樣品的測定:采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行測定,稱取1.0 g果蔬樣品,加入5 mL蒸餾水研磨成勻漿后,然后10000 r·min-1,離心20 min,取上清液為可溶性蛋白質(zhì)提取液。吸取400 μL上清液,加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,充分混合,放置2 min后于波長595 nm處比色測定吸光值,結(jié)果以每克鮮重所含可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量表示,計算公式為:

（2）推廣應(yīng)用PPP模式，積極促進(jìn)小微企業(yè)申報PPP項目，實行“隨報隨收、隨收隨審”的原則，使河南省自貿(mào)區(qū)發(fā)展實現(xiàn)市場化融資。

式中:m′-標(biāo)曲中查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量,μg;V-樣品提取液體積,mL;Vs-測定所取樣品提取液體積,mL;m-樣品質(zhì)量,g。

1.2.7 木質(zhì)素含量測定 參考陳發(fā)河[16]的方法,取1 g樣品,加5 mL 95%乙醇研磨,于3000×g離心7 min,沉淀物以95%乙醇沖洗3次,再用乙醇∶正己烷(1∶2,V∶V)沖洗3次,收集沉淀物使其干燥,干燥物溶于25%溴乙酰冰醋酸溶液中,70 ℃恒溫水浴中加塞保溫30 min,然后加入0.9 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),再加5 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol·L-1羥胺鹽酸,并以冰醋酸定容至10 mL,,再用冰醋酸稀釋125倍得到樣品提取液,取上清液在280 nm處測定吸光度值,以O(shè)D280nm·g-1FW表示木質(zhì)素的含量。

1.2.8 總酚含量的測定 參考曹建康[15]方法并稍加修改。取2.0 g果肉組織,加少許預(yù)冷的1% HCl-甲醇,冰浴研磨至勻漿,轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中,用1% HCl-甲醇溶液定容至刻度,混勻后避光提取20 min,每隔5 min搖動一次,然后5000×g,離心15 min,取樣品提取液,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

以1% HCl-甲醇溶液作空白,上清液用1% HCl-甲醇溶液稀釋10倍后,在280 nm處測定吸光值,結(jié)果以O(shè)D280nm·g-1表示總酚相對含量。

1.2.9 呼吸速率 采用果蔬呼吸測定儀測定。隨機(jī)選取3個果實,每天同一時間置于容積為2 L的呼吸室中,進(jìn)行測定,結(jié)果以mg/kg·h表示。

1.3 統(tǒng)計分析

4、25 ℃處理平行3個組中隨機(jī)取3組樣品,并且每項指標(biāo)重復(fù)3次測定,實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Origin 8軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Duncan法檢驗差異顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下番荔枝失重率和硬度變化

采后果蔬的呼吸作用會直接導(dǎo)致其重量的損失,并且還會進(jìn)一步影響其生理代謝和營養(yǎng)品質(zhì)。失重率和硬度的變化直接反映采后番荔枝品質(zhì)的變化,失重率越高表明果蔬品質(zhì)下降越嚴(yán)重[17]。如圖1a所示,隨著貯藏時間的增加,不同貯藏溫度的番荔枝果實失重率均呈增加趨勢,這可能是由于番荔枝表面受到輕微的機(jī)械損傷,導(dǎo)致水分流失,并且伴隨著果實變軟和果皮變黑等癥狀。貯藏第5 d,25 ℃貯藏的番荔枝果實失重率達(dá)6.63%,而4 ℃貯藏的番荔枝果實到貯藏第14 d,失重率僅為5.21%。在整個貯藏期間,25 ℃貯藏番荔枝果實失重率顯著高于4 ℃貯藏組(p<0.05)。由此可見,低溫貯藏對于延緩番荔枝果實的失重率效果明顯。

如圖1b所示,不同貯藏溫度的番荔枝果實硬度在整個貯藏過程中均呈下降趨勢,25 ℃貯藏的果實硬度在第2 d急劇下降,而4 ℃貯藏的果實硬度降低較緩慢。在整個貯藏期間,4 ℃貯藏的果實硬度始終顯著高于25 ℃的果實硬度(p<0.05)。25 ℃貯藏的果實硬度從貯藏第0 d的8.79 N下降至貯藏第15 d的2.05 N,而4 ℃貯藏0～14 d時果實硬度從9.18 N下降至2.78 N,這表明,低溫能較好的維持采后番荔枝果實的硬度,從而保持果實品質(zhì)。

圖1 不同貯藏溫度番荔枝失重率和硬度的變化Fig.1 Changes of weight loss rate and firmness during storage of Annona squamosa L.at different temperatures

2.2 采后番荔枝果實細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

經(jīng)掃描電鏡觀察,新鮮的番荔枝果實具有規(guī)則的表面,結(jié)構(gòu)更完整,更致密(圖2a)。經(jīng)過貯藏后的番荔枝果實變得松散多孔,表面出現(xiàn)了很多孔隙(圖2b、c)。經(jīng)透射電鏡觀察,新鮮的番荔枝細(xì)胞壁很薄,并且顏色很淺(圖2d)。細(xì)胞壁顯示不均勻增厚,呈現(xiàn)顆粒層,凹坑在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)沉積,木質(zhì)素顆粒沿細(xì)胞壁內(nèi)部沉積,形成完全木質(zhì)化的細(xì)胞(圖2e、f),這與Suo等[18]對獼猴桃的觀察結(jié)果一致。

圖2 不同溫度貯藏下番荔枝果實細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.2 Cell structure of during storage of Annona squamosa L.at different temperatures注:a、b、c:TEM;d、e、f:SEM;a、d:新鮮果實;b、e:4 ℃貯藏果實;c、f:25 ℃貯藏果實;CW:細(xì)胞壁;LG:木質(zhì)化細(xì)胞群。

2.3 不同貯藏溫度下番荔枝可溶性固形物含量變化

TSS是包含可溶性糖、酸、纖維素、礦物質(zhì)等成分的綜合型指標(biāo),能直接反映果實品質(zhì)及后熟衰老的情況[19]。由圖3可知,不同貯藏溫度果實的TSS含量在貯藏期間均呈先上升后下降的趨勢。25 ℃貯藏的番荔枝果實中的TSS含量在貯藏前3 d迅速上升,到第3 d達(dá)到峰值,為21.3%,隨后又急劇下降;而4 ℃貯藏的番荔枝果實的TSS含量在貯藏前期平緩上升,到第8 d達(dá)到峰值,為21.6%,隨后緩慢下降。貯藏后期,TSS含量下降可能是由于沉淀出部分可溶性膠體或發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng),消耗了體內(nèi)的糖分。在貯藏2～4 d,4 ℃貯藏組與25 ℃貯藏組呈現(xiàn)出顯著性差異(p<0.05)。

圖3 不同貯藏溫度番荔枝可溶性固形物的變化Fig.3 Changes of TSS content during storage of Annona squamosa L.at different temperatures

2.4 不同貯藏溫度下番荔枝可溶性蛋白含量變化

可溶性蛋白質(zhì)是果蔬代謝的主要調(diào)控和促進(jìn)物質(zhì),與采后果蔬的生長發(fā)育、成熟衰老等密切相關(guān)[20]。如圖4所示,采后番荔枝在25 ℃條件下可溶性蛋白質(zhì)含量在貯藏期間急劇下降,由第0 d的3.35 mg/g不斷降低至第5 d的1.17 mg/g;4 ℃條件下的番荔枝可溶性蛋白質(zhì)含量先緩慢上升,由第0 d的2.23 mg/g到第4 d的3.23 mg/g,達(dá)到最大值,隨后不斷下降;在貯藏第2～5 d,4 ℃貯藏的番荔枝可溶性蛋白質(zhì)含量都顯著高于25 ℃貯藏的番荔枝(p<0.05)。因此,低溫顯著抑制了可溶性蛋白質(zhì)含量的下降,有利于番荔枝保持其營養(yǎng)品質(zhì)。

圖4 不同貯藏溫度番荔枝可溶性蛋白的變化Fig.4 Changes of soluble protein content during storage of Annona squamosa L.at different temperatures

2.5 不同貯藏溫度下番荔枝木質(zhì)素含量變化

木質(zhì)素作為次生代謝產(chǎn)物,是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分[21],木質(zhì)素的形成和積累是導(dǎo)致采后番荔枝果實品質(zhì)劣變的主要原因之一。如圖5所示,采后番荔枝木質(zhì)素含量在不同貯藏溫度期間均呈增加趨勢,4 ℃處理果實的木質(zhì)素含量增加緩慢,在貯藏第5 d,25 ℃貯藏的番荔枝木質(zhì)素含量比第0 d增加了44.47%,而4 ℃貯藏的番荔枝木質(zhì)素含量到第5 d僅增加了30.48%。同時,整個貯藏期間,4 ℃貯藏的木質(zhì)素含量始終顯著低于在25 ℃貯藏的番荔枝(p<0.05),這與楊敏等[10]對山竹的研究結(jié)果一致。結(jié)果表明,低溫貯藏能顯著抑制番荔枝木質(zhì)素的形成,延緩果實的木質(zhì)化。

圖5 不同貯藏溫度番荔枝木質(zhì)素的變化Fig.5 Lignin changes of during storage of Annona squamosa L.at different temperatures

2.6 不同貯藏溫度下番荔枝總酚含量變化

總酚是果蔬組織產(chǎn)生的主要次生代謝產(chǎn)物,與果蔬的風(fēng)味品質(zhì)、成熟衰老有著密切的關(guān)系[22]。如圖6所示,25 ℃貯藏條件下,總酚含量在前2 d不斷上升,達(dá)到最大值,然后迅速下降。酚類物質(zhì)作為合成木質(zhì)素的前體物質(zhì),隨著木質(zhì)素的不斷合成,導(dǎo)致總酚含量在貯藏后期不斷下降。而4 ℃貯藏條件下,番荔枝的總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降最后上升的趨勢,貯藏初期總酚含量上升可能是番荔枝果實表面受到輕微的機(jī)械損傷;貯藏中期總酚含量下降,可能是由于酚類物質(zhì)參與木質(zhì)素合成和酶促褐變所消耗的量大于生成量;而貯藏后期總酚含量上升可能是由于低溫貯藏使果實組織內(nèi)酶活性提高,導(dǎo)致酚類物質(zhì)合成加快。番荔枝總酚的含量與木質(zhì)素的合成有著密切的關(guān)系[23]。在整個貯藏期間,25 ℃貯藏番荔枝果實總酚含量顯著高于4 ℃貯藏組(p<0.05)由圖6可知,低溫處理能夠在一定程度上抑制番荔枝的總酚水平。

圖6 不同貯藏溫度番荔枝總酚含量的變化Fig.6 Changes of total phenols content during storage of Annona squamosa L.at different temperatures

2.7 不同貯藏溫度采后番荔枝呼吸速率的變化

呼吸作用是衡量采后果蔬新陳代謝強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[24]。番荔枝是典型的呼吸躍變型果實,如圖7所示,在25 ℃貯藏期間,番荔枝果實在第2 d出現(xiàn)躍變高峰,呼吸速率達(dá)到600.23 mg/kg·h,而在貯藏后期,隨著番荔枝的衰老,呈迅速下降的趨勢,第5 d時迅速降至307.85 mg/kg·h。與25 ℃相比,4 ℃貯藏的番荔枝呼吸速率在整個貯藏期間都維持在較低的水平,差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明,低溫貯藏在很大程度上可以有效抑制番荔枝果實的呼吸強(qiáng)度,從而延緩番荔枝果實的后熟衰老。

圖7 不同貯藏溫度番荔枝呼吸速率的變化Fig.7 Changes of respiratory rate during storage of Annona squamosa L.at different temperatures

3 結(jié)論

番荔枝是呼吸躍變型果實,25 ℃貯藏條件下,番荔枝果實在第2 d出現(xiàn)躍變高峰,隨后迅速下降,4 ℃貯藏的番荔枝呼吸速率在整個貯藏期間都維持在較低的水平。同時,4 ℃貯藏能有效地維持采后番荔枝果實的硬度,減少重量的損失,延緩貯藏前期TSS含量的上升以及可溶性蛋白含量的下降,并且能夠明顯地抑制番荔枝的總酚含量以及木質(zhì)素含量,減少了番荔枝果實木質(zhì)素的積累,延緩果實的成熟衰老,進(jìn)而延長貯藏期。

低溫貯藏可以有效抑制番荔枝的呼吸強(qiáng)度和木質(zhì)素的合成,較好地保持番荔枝的貯藏品質(zhì),延緩果實木質(zhì)化現(xiàn)象和后熟進(jìn)程。但從基因表達(dá)、代謝組學(xué)等角度對番荔枝果實木質(zhì)化現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)理和品質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)研究還有待深入,這也是今后番荔枝采后冷鏈集散和流通中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。