胡晶晶,張怡馨,王 艷,莫宇麗,王 杰

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

隨著人們健康意識的增強,以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品與添加劑行業(yè)的發(fā)展趨勢。作為一種新型的天然強抗氧化劑,麥角硫因不僅能抑制和清除由氧化反應引起的食品變味、變色與酸敗,而且對人體能起到抗衰老、提高免疫力、減少某些疾病發(fā)生率的作用,在食品添加劑、保健品、化妝品等領域具有巨大的應用潛力[1-4]。金針菇等食用菌中麥角硫因的含量遠高于其它的麥角硫因合成生物,而食用菌又具備人們所需的天然安全性,又有易培養(yǎng)、周期短等優(yōu)勢,成為獲取麥角硫因的最佳來源[5-7]。

原材料的預處理方式通過影響活性成分的活性進而影響其提取量。所選溶劑會直接影響有效成分從植物組織中溶解出來的效率[8-9]。Bao等[10]以70%的丙酮作為提取溶劑提取金針菇中的麥角硫因,得到金針菇子實體中麥角硫因含量為(3.03±0.07) mg/g干重;張翠等[11]以去離子水作為提取溶劑,100 ℃加熱回流來提取多種食用菌中的麥角硫因,測得金針菇中麥角硫因的含量為0.186%。除此之外,提取方法對提取量也有很大的影響,不同的提取方法都有其優(yōu)劣勢。傳統(tǒng)的提取方法操作簡單,儀器輔助提取效率高。目前,國內(nèi)外對麥角硫因的研究多集中于功能特性,關于其提取純化方面的研究較少[12-16],采用響應面對提取方法進行工藝優(yōu)化鮮有報道[17],而市場對麥角硫因存在著巨大需求。響應面法是一種有效的統(tǒng)計方法,通過分析實驗數(shù)據(jù),建立數(shù)學模型,從而解決受多因素影響的最優(yōu)組合問題[18]。為此,本論文以金針菇為對象,選擇提取溶劑與提取方法,利用響應面法優(yōu)化金針菇中麥角硫因的提取工藝,為金針菇中麥角硫因的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇 廣東藍田農(nóng)業(yè)有限公司;麥角硫因標準品 美國Sigma公司;磷酸二氫鉀、磷酸、鹽酸、乙醇、甲醇、丙酮等 均為國產(chǎn)分析純,廣州成碩試劑公司;甲醇、乙腈 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

LC2130高效液相色譜儀 上海天美科學儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機 天津比朗實驗儀器制造有限公司;MAS-Ⅱ常壓微波萃取儀 上海新儀微波化學科技有限公司;JY92-2D超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海紫裕生物科技有限公司;HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金針菇粉的制備 取一定量新鮮金針菇,洗凈后分裝于自封袋中并置于-70 ℃冰箱12 h。真空凍干機冷阱溫度-50 ℃以下,真空度20 Pa以下干燥直至恒重。將干燥后的金針菇取出,置于高速粉碎機中充分粉碎,過70目不銹鋼網(wǎng)篩,置于-20 ℃冰箱中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 溶劑提取法 將冷凍干燥處理所得的金針菇粉與54%乙醇以液料比48∶1 (g/mL)混合,即準確稱量0.5 g金針菇粉,將24 mL的54%乙醇緩慢加入,邊加邊攪拌,將結(jié)塊的菇粉盡量攪拌開,使菇粉與提取劑最大面積接觸,即得到固液混合物;將固液混合物于70 ℃恒溫水浴提取30 min,混合物常溫下8000 r/min離心10 min后收集上清液,用54%乙醇定容上清液至50 mL,檢測麥角硫因提取量。在前期預實驗的基礎上確定實驗最佳參數(shù)。

1.2.3 超聲輔助溶劑提取法 使用超聲細胞粉碎儀將固液混合物于超聲功率440 W、超聲時間5 min條件下提取。將提取液離心后收集上清液,用54%乙醇定容至50 mL,檢測麥角硫因提取量。

1.2.4 微波超聲聯(lián)合提取法 使用微波萃取儀將固液混合物于微波功率400 W、微波溫度70 ℃下處理5 min,再使用超聲細胞粉碎儀于超聲功率440 W、超聲時間5 min條件下提取;將提取液離心后收集上清液,用54%乙醇定容至50 mL,檢測麥角硫因提取量。

1.2.5 二次提取法 二次提取法即為在溶劑提取法的基礎上,向離心取出上清液后的殘渣再次加入提取溶劑54%乙醇,并振蕩使殘渣與提取溶劑充分接觸后,再次以溶劑提取法的條件進行二次提取,同樣離心后收集上清液;合并兩次收集的上清液,用54%乙醇定容至50 mL,檢測麥角硫因提取量。

1.2.6 溶劑提取法提取金針菇中麥角硫因的單因素實驗

1.2.6.1 液料比對麥角硫因提取量的影響 用80%乙醇分別以不同液料比(mL/g)20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1與金針菇粉充分混合,在70 ℃下水浴浸提30 min,取出后于10000r/min離心10 min后收集上清液,80%乙醇定容至50 mL,并測定麥角硫因提取量。

1.2.6.2 乙醇濃度對麥角硫因提取量的影響 分別用去離子水、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇作為提取溶劑,以液料比50∶1 (mL/g)與金針菇粉充分混合,在70 ℃下水浴浸提30 min,取出后于10000 r/min離心10 min后收集上清液,用相應的提取溶劑定容至50 mL,并測定麥角硫因提取量。

1.2.6.3 提取溫度對麥角硫因提取量的影響 用60%乙醇以液料比50∶1 (mL/g)與金針菇粉充分混合,分別在40、50、60、70、80、90和100 ℃下水浴浸提30 min,取出后于10000 r/min離心10 min后收集上清液,60%乙醇定容至50 mL,并測定麥角硫因提取量。

1.2.6.4 提取時間對麥角硫因提取量的影響 用60%乙醇以液料比50∶1 (mL/g)與金針菇粉充分混合,在50 ℃條件下分別水浴浸提2、5、15、30、45、65、85、105和120 min,取出后于10000 r/min離心10 min后收集上清液,60%乙醇定容至50 mL,并測定麥角硫因提取量。

1.2.6.5 響應面法優(yōu)化金針菇中麥角硫因的提取工藝 根據(jù)前期各個單因素實驗分析的結(jié)果,選取單因素實驗中對提取量影響較大的三種因素:乙醇濃度、提取溫度、液料比,采用 Design Expert 8.0.6 軟件中的Box-benhnken實驗設計原理進行優(yōu)化設計[19],響應面實驗設計因素水平表見表 1。

表1 響應面實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.7 提取液中麥角硫因濃度的檢測方法 采用高效液相色譜法(HPLC)檢測提取液中麥角硫因的濃度[20]。檢測條件:色譜柱為5 μm C18色譜柱,柱溫30 ℃;流動相為水∶甲醇=98∶2,流速為1 mL/min,檢測波長為254 nm,進樣量為20 μL。

標準曲線的制作:將1 mg麥角硫因標準品用10 mL提取溶劑溶解,制成濃度為0.1 mg/mL(100 μg/mL)的標準品原液,再將原液分別稀釋成75、50、25和5 μg/mL的麥角硫因標準品溶液,標準品和提取液均進HPLC,使用以上檢測條件檢測;以麥角硫因濃度(mg/mL)為縱坐標,以峰面積(μAU·s)為橫坐標,繪制麥角硫因標準曲線,得出曲線回歸方程:y=1.41117×10-8x+8.14078×10-5,R2=0.99994,其中y為麥角硫因濃度,x為峰面積。

1.2.8 麥角硫因提取量的計算 計算公式為:

式中,Y為麥角硫因的提取量(mg/g),y為按照標準曲線計算得出的麥角硫因濃度(mg/mL),V為進液相前溶液定容的體積(mL),m為稱取金針菇粉的質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次,采用 Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析,利用SPSS 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,Origin 8.6進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對金針菇中麥角硫因提取量的影響

由圖1,比較不同提取方法所得麥角硫因的提取量,4種提取方法中麥角硫因得率大小順序為:二次提取法>溶劑提取法>微波-超聲聯(lián)合提取>超聲提取。其中,溶劑二次提取法顯著(p<0.05)高于其他提取方法。在大量使用超聲波輔助萃取、微波-超聲輔助萃取技術(shù)的研究中,均提出這些方法相較于常規(guī)的溶劑提取法具有快捷省時、能耗少、有效成分得率高等優(yōu)勢[21-22]。而本實驗中,使用超聲提取和微波-超聲聯(lián)合提取金針菇粉中的麥角硫因,其提取量卻低于溶劑提取法的提取量,與其他活性物質(zhì)提取研究中的結(jié)果大相徑庭。推測可能跟金針菇特殊的細胞結(jié)構(gòu)特征有關,導致發(fā)揮不了超聲對提取過程的強化作用,甚至可能超聲或微波導致了提取物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)發(fā)生改變,使提取率降低[23]。二次提取法是在溶劑提取法的基礎上進行第二次提取,但其麥角硫因的提取量僅比溶劑提取法高12%左右,因而從節(jié)省試劑和時間的角度出發(fā),之后的提取過程均采取一次提取,即溶劑提取法。

圖1 提取方法對金針菇中麥角硫因提取量的影響Fig.1 Effect of extraction method on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine注:不同小寫字母表示每種方法之間的差異顯著(p<0.05)。

2.2 溶劑提取法提取金針菇中麥角硫因的單因素實驗

2.2.1 液料比對金針菇中麥角硫因提取量的影響 由圖2所示,用80%乙醇做提取劑,檢測不同液料比對金針菇中麥角硫因提取量的影響。液料比不同對麥角硫因的提取率有一定的影響,這與薛天凱等[24]的研究報道變化趨勢一致;在液料比20∶1～50∶1的范圍內(nèi)隨著乙醇溶液用量的增加,麥角硫因提取量逐漸升高,可能的原因是當乙醇溶液用量少時,乙醇溶液黏度較高,分子擴散慢,體系分散不均勻[25];在液料比50∶1提取量最高。隨著溶劑用量的增大,會增大工藝成本,增加能耗和后續(xù)操作的時間,故為節(jié)約資源實驗,提高效率,適宜的液料比為50∶1。

圖2 液料比對金針菇中麥角硫因提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖3～圖5同。

2.2.2 乙醇濃度對金針菇中麥角硫因提取量的影響 結(jié)果如圖3所示,金針菇中麥角硫因的提取量隨著提取溶劑中乙醇濃度的升高先升高后下降,并且以60%乙醇為提取溶劑時的提取量顯著(p<0.05)高于其他乙醇濃度的提取溶劑,平均為2.237 mg/g(干重)。這與其他活性物質(zhì)的研究報道變化趨勢一致[26]。可能的原因是隨著乙醇濃度的上升,增加了乙醇與麥角硫因的接觸機會,導致麥角硫因較多地溶解在乙醇中。但當溶液中乙醇濃度達到一定范圍時,提取量反而下降,可能的原因是乙醇濃度增大使得一些醇溶性雜質(zhì)溶出量增加，從而與麥角硫因競爭,導致提取量下降[27]。從節(jié)約資源與成本的因素考慮,乙醇濃度60%為宜。

圖3 乙醇濃度對金針菇中麥角硫因提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol ratio on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine

2.2.3 提取溫度對金針菇中麥角硫因提取量的影響 結(jié)果如圖4所示,麥角硫因的提取量在提取溫度40～100 ℃的范圍內(nèi)先升后降,于50 ℃達到最高值平均2.56 mg/g(干重),并且顯著(p<0.05)高于其他提取溫度下的提取量。這與劉楊等[28]考察提取溫度對活性物質(zhì)多酚提取率的影響的研究結(jié)果一致。可能的原因是溫度越高,分子運動加快,提取劑與菇粉分子間碰撞越激烈,且溫度升高能夠降低提取溶劑的黏度,促進溶劑介質(zhì)的傳遞,增加麥角硫因在乙醇中的溶解度。溫度高于50 ℃后麥角硫因提取量呈下降趨勢,可能的原因有:一是高溫下麥角硫因不穩(wěn)定;二是高溫提取激活了細胞的某種保護機制,消耗了細胞內(nèi)的麥角硫因;三是雖然溫度升高使胞內(nèi)物質(zhì)溶出度增高,但不僅是麥角硫因,蛋白、多糖等大分子和其他雜質(zhì)在提取液中的濃度也隨之提高,從而與麥角硫因形成競爭,故而使提取量下降。因此適宜的提取溫度為50 ℃。

圖4 提取溫度對金針菇中麥角硫因提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine

2.2.4 提取時間對金針菇中麥角硫因提取量的影響 結(jié)果如圖5所示,在2～15 min之間,提取量有緩慢上升的趨勢,但差異并不顯著,這是因為開始時麥角硫因沒有完全溶解,隨著時間增加,水溶性麥角硫因不斷溶出。提取時間為15 min時提取量最大,平均值2.87 mg/g(干重),最高值可達3.11 mg/g(干重),從節(jié)約時間和提取率的角度出發(fā),提取時間控制在15 min較好。

圖5 提取時間對金針菇中麥角硫因提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of Flammulina velutipes ergothioneine

2.3 響應面法優(yōu)化金針菇中麥角硫因的提取工藝

2.3.1 響應面試驗設計方案及結(jié)果 綜合單因素實驗結(jié)果,固定提取時間15 min,選取乙醇濃度(X1)、溫度(X2)、液料比(X3)3個因素,在單因素實驗基礎上，采用三因素三水平利用Design Expert 8.0.6 軟件中的Box-benhnken實驗設計原理進行響應面設計,根據(jù)試驗設計確定的試驗方案對麥角硫因提取進行優(yōu)化,試驗方案及結(jié)果見表2。所獲得麥角硫因的提取量優(yōu)化擬合方程為:

表2 麥角硫因提取的響應面試驗方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.3 交互作用分析 為了進一步研究相關變量之間的作用以及確定最優(yōu)點,通過 Design Expert 軟件繪制響應面曲線圖來進行可視化分析,圖6～圖11分別顯示3組以麥角硫因提取量為響應值的趨勢圖,反映了兩被測變量間交互作用顯著與否,橢圓表示的是兩因素交互作用顯著,圓形則表示不顯著[29]。

圖6、圖7分別為乙醇濃度和溫度對麥角硫因提取量的響應面圖、等高線圖。固定液料比為50∶1,隨著溫度和乙醇濃度的增加,麥角硫因的提取量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。乙醇濃度軸向等高線更為密集,乙醇濃度對提取量的影響極明顯,溫度軸向等高線相對稀疏,表明其對提取量的影響相對乙醇濃度較小(圖7)。結(jié)合表3,得出結(jié)論:麥角硫因提取量對乙醇濃度的變化比溫度的變化敏感,兩因素具有一定的交互作用,但交互作用不顯著(p>0.05)。響應曲面圖開口向下,表明在實驗所選范圍內(nèi)存在極大值,在乙醇濃度60%～70%、溫度45～55 ℃內(nèi)為最佳水平范圍。

圖6 乙醇濃度和溫度對麥角硫因提取量的響應面圖Fig.6 Response surface showing the effect of ethanol ratio and temperature on the yield of ergothioneine

圖7 乙醇濃度和溫度對麥角硫因提取量的等高線Fig.7 Corresponding contour plots showing the effect of ethanol ratio and temperature on the yield of ergothioneine

圖8、圖9分別為乙醇濃度和液料比對麥角硫因提取量的響應面圖、等高線圖。等高線近似成圓形。固定溫度為50 ℃,隨著液料比和乙醇濃度的增加,麥角硫因的提取量呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。乙醇濃度軸向等高線更為密集,乙醇濃度對提取量的影響極顯著(圖8),液料比軸向等高線相對稀疏,表明其對提取量的影響相對較小(圖9)。結(jié)合表3,得出結(jié)論:麥角硫因提取量對乙醇濃度的變化比液料比的變化敏感,兩因素具有一定的交互作用,但不顯著(p>0.05)。此外,響應曲面圖開口向下,表明在實驗所選范圍內(nèi)存在極大值,在乙醇濃度60%～70%、液料比45∶1～55∶1內(nèi)為最佳水平范圍。

圖8 乙醇濃度和液料比對麥角硫因提取量的響應面圖Fig.8 Response surface showing the effect of liquid-solid ratio and ethanol ratio on the yield of ergothioneine

圖9 乙醇濃度和液料比對麥角硫因提取量的等高線Fig.9 Corresponding contour plots showing the effect of liquid-solid ratio and ethanol ratio on the yield of ergothioneine

圖10、圖11分別為液料比和溫度對麥角硫因提取量的響應面圖、等高線圖。如圖所示,溫度的坡面較液料比的陡,等高線為圓形。固定乙醇濃度為60%,隨著溫度和液料比的增加,麥角硫因的提取量呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。沿溫度軸向等高線密集,而液料比軸向等高線相對稀疏,結(jié)合表3,說明麥角硫因提取量對溫度的變化比對液料比的變化更為敏感,但兩因素的交互作用不顯著(p>0.05)。響應曲面圖開口向下,表明在實驗所選范圍內(nèi)存在極大值,在液料比45∶1～55∶1、溫度50～55 ℃內(nèi)為最佳水平范圍。

圖10 液料比和溫度對麥角硫因提取量的響應面圖Fig.10 Response surface showing the effect of liquid-solid ratio and temperature on the yield of ergothioneine

圖11 液料比和溫度對麥角硫因提取量的等高線Fig.11 Corresponding contour plots showing the effect of liquid-solid ratio and temperature on the yield of ergothioneine

2.3.4 最佳工藝確定與驗證 經(jīng)過模型預測得到最佳工藝條件為:乙醇濃度62.21%,液料比57.54∶1,溫度52.34 ℃。為方便操作將麥角硫因的提取最佳工藝條件改為乙醇濃度62%,液料比58∶1,溫度53 ℃,代入擬合方程得到的提取量為3.48(mg/g干重),此條件下進行3 個平行試驗驗證,麥角硫因的提取量為(3.53±0.09) mg/g干重。實測值與預測值相近,證明用響應面法優(yōu)化麥角硫因提取的工藝是可行的。

3 結(jié)論

不同提取方法對金針菇麥角硫因提取量影響的研究結(jié)果表明:不同的提取方法可顯著(p<0.05)影響金針菇麥角硫因的提取量,其中,溶劑二次提取法>溶劑提取法>微波超聲聯(lián)合提取法>超聲提取法。通過單因素實驗和響應面法優(yōu)化溶劑提取法提取麥角硫因的條件，結(jié)果表明:在所選取的單因素中,對提取量影響較大的三個因素分別為提取溫度、液料比和乙醇濃度;單因素和響應面法得到的最優(yōu)提取條件為:提取時間15 min,乙醇濃度62%,液料比58∶1,溫度53 ℃,此條件下麥角硫因的提取量為(3.53±0.09) mg/g干重。優(yōu)化模型能較好地預測溶劑提取麥角硫因提取量。