張苗苗,柴海毅,費(fèi)國(guó)琴,寧喜斌,3,4,5,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306; 2.上海諾狄生物科技有限公司,上海 201612; 3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 4.國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心(上海),上海 201306; 5.上海海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306)

潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境需要保證空氣中懸浮粒子被控制在合適的級(jí)別,以確保完成對(duì)污染敏感的有關(guān)活動(dòng)。細(xì)菌可能污染工業(yè)食品生產(chǎn)潔凈室或制藥潔凈室環(huán)境,需要采取有效措施加以控制,以盡量避免對(duì)人體的健康危害以及造成的經(jīng)濟(jì)損失[1],因此為達(dá)到潔凈室環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)要求,在潔凈室構(gòu)建和配備標(biāo)準(zhǔn)化后,持續(xù)監(jiān)測(cè)潔凈室微生物的存在狀態(tài)十分必要。1881年Koch將固體培養(yǎng)基表面暴露在空氣中一定時(shí)間,然后在一定的條件下培養(yǎng),通過對(duì)培養(yǎng)基上可培養(yǎng)的菌落計(jì)數(shù)[2],引入了空氣采樣的沉降菌檢測(cè)方法,現(xiàn)在是GMP標(biāo)準(zhǔn)中用于進(jìn)行監(jiān)測(cè)控制A級(jí)環(huán)境的方法之一。近年來對(duì)潔凈環(huán)境空氣微生物的來源、粒子特征、主要類型、濃度的時(shí)空變化及其群落結(jié)構(gòu)的研究也得到越來越多的關(guān)注。隨著我國(guó)GMP制度的發(fā)展,不僅僅是對(duì)藥品,對(duì)食品生產(chǎn)環(huán)境中的控制要求也越來越嚴(yán)格。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)芽孢桿菌是潔凈環(huán)境污染的重要原因之一[3]。由于芽孢具有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu),所以折光性強(qiáng)、對(duì)染料不易著色,芽孢對(duì)熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強(qiáng)的抵抗力[4-5],所以,產(chǎn)芽孢桿菌在潔凈環(huán)境中定殖,將會(huì)對(duì)潔凈環(huán)境安全性造成威脅。

潔凈環(huán)境中殺菌可能不充分,Simmons等[6]對(duì)美國(guó)23家醫(yī)院在手動(dòng)清潔后進(jìn)行了脈沖氙氣紫外線燈(PX-UV)消毒,通過微生物學(xué)驗(yàn)證,結(jié)果顯示手動(dòng)清洗后的每平板CFU范圍為5.8～34.37,PX-UV消毒后的每平板CFU范圍為0.69～6.43,環(huán)境中微生物數(shù)量顯著降低,但沒有對(duì)PX-UV消毒后的環(huán)境中微生物進(jìn)行鑒定,未能了解污染環(huán)境中的微生物類群。呂洪浩等[7]對(duì)部分潔凈室沉降菌檢測(cè),發(fā)現(xiàn)一般潔凈空氣中以細(xì)菌為主,有少量真菌及放線菌,也沒有對(duì)相應(yīng)的微生物控制進(jìn)一步開展研究。目前對(duì)潔凈環(huán)境的研究主要是如何檢測(cè)環(huán)境內(nèi)微生物數(shù)量,判斷是否達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn),但對(duì)于微生物的鑒定研究較少[8-10],并且沒有對(duì)潔凈環(huán)境中,抗逆性較強(qiáng)的微生物控制提出合理的解決方法。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行分離純化,對(duì)受在控潔凈環(huán)境空氣中獲得的沉降菌的芽孢桿菌的特征進(jìn)行研究,并通過16S rDNA進(jìn)行同源性比較,探究污染環(huán)境的主要芽孢桿菌種類,并用K-B法測(cè)其對(duì)20種抗生素的耐受性,以期為潔凈環(huán)境中芽孢桿菌的安全風(fēng)險(xiǎn)控制提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

62株潔凈環(huán)境分離菌株 諾狄公司分離自藥廠;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、細(xì)菌生化鑒定試劑 青島海博生物技術(shù)有限公司;TSA無菌預(yù)罐裝成品培養(yǎng)基平板(沉降碟)((90 mm) 上海諾狄生物科技有限公司;革蘭氏染色液試劑盒 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;藥敏試紙片 杭州微生物試劑有限公司;DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;孔雀石綠、PCR引物、TAE緩沖液、EB染液等 生工(上海)有限公司。

THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床、THZ-300隔水式培養(yǎng)箱9270 上海一恒科技有限公司;ClassⅡBSC生物安全柜 ESCO公司;JA1003電子天平 常州市宏恒電子儀器廠;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;PTC-200PCR儀、GelDocXR凝膠成像儀 Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沉降菌檢測(cè) 根據(jù)國(guó)標(biāo)醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測(cè)試方法(GB/T 16294-2010),對(duì)受控環(huán)境(細(xì)胞房及生物安全柜)和非受控環(huán)境(教室、宿舍等)沉降菌進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,測(cè)試前對(duì)沉降碟包裝、沉降碟表面進(jìn)行嚴(yán)格消毒,按采樣點(diǎn)布置圖[11]逐個(gè)放置,然后由里向外逐個(gè)打開沉降碟,使培養(yǎng)基表面暴露在空氣中,暴露時(shí)間為4 h。在32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 菌落菌體形態(tài)觀察 挑取沉降碟上微生物在TSA培養(yǎng)基四區(qū)劃線進(jìn)行分離純化,32 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落、菌體(革蘭氏染色)形態(tài),采用Schaeffer-Fulton氏染色法染色[12],觀察是否有芽孢。

1.2.3 生理生化鑒定 用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)產(chǎn)芽孢菌株進(jìn)行鑒定,包括過氧化氫酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、V-P 試驗(yàn)、水解、檸檬酸鹽、卵黃卵磷脂酶、溶菌酶耐性試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)原理及結(jié)果參考伯杰氏常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[13]和常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[14]。

1.2.4 16S rDNA基因序列 將產(chǎn)芽孢菌株用TSB液體培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)12 h,按照細(xì)菌總DNA提取試劑盒說明書步驟操作,提取細(xì)菌總DNA,即為模板DNA。擴(kuò)增16S rDNA基因所用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括:2×Taq PCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上下游引物各2 μL,模板DNA 1 μL,用20 μL的無菌ddH2O調(diào)整為最終反應(yīng)體系。

PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán)。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果,觀察是否有清晰明亮的條帶,使用瓊脂糖凝膠回收法純化PCR產(chǎn)物后,送交上海生工生物技術(shù)工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株的16S rDNA基因序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì),選擇同源性高于90%的相關(guān)菌株的核酸序列,在LPSN下載其16S rDNA基因序列并通過Mega 5.2完成序列比對(duì)后,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 產(chǎn)芽孢桿菌耐藥性檢測(cè) 將純化后的待測(cè)產(chǎn)芽孢桿菌接種于TSB中,32 ℃、120 r/min培養(yǎng)18 h。將菌液8000 r/min,離心2 min后棄去上清液,取種子液調(diào)節(jié)OD600使得其接種量為1.5×108CFU/mL,用棉拭子吸取菌液,在TSA培養(yǎng)基表面進(jìn)行涂布,待培養(yǎng)基表面菌液完全晾干后貼上抗生素紙片(抗生素種類如表1),置于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[15],測(cè)量抑菌圈的直徑,判斷產(chǎn)芽孢桿菌對(duì)該抗生素是否具有耐藥性。

表1 實(shí)驗(yàn)所用藥敏紙片Table 1 Drug sensitive paper used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境沉降菌的比較

為了了解環(huán)境中沉降菌的狀況,本研究選取了上海海洋大學(xué)不同潔凈環(huán)境進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果如表2。

由表2可知,同等受控環(huán)境菌落數(shù)相似,非受控環(huán)境中沉降菌菌落數(shù)為22.4～32.4 CFU/平板,檢測(cè)結(jié)果與環(huán)境中人的數(shù)量、氣候以及檢驗(yàn)人員是否受過專業(yè)培訓(xùn)有較大的關(guān)系。

表2 不同環(huán)境4 h沉降菌數(shù)量Table 2 Number of settled bacteria in different environments for 4 h

沉降碟在暴露4 h后,32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,明顯發(fā)現(xiàn)受控度越高,環(huán)境中微生物數(shù)量越少;不同環(huán)境中沉降菌種類亦有較大的差異。非受控環(huán)境,菌落數(shù)量多,種類復(fù)雜,且菌絲蔓延生長(zhǎng),對(duì)菌落計(jì)數(shù)、觀察菌落形態(tài)和分離出單菌落都有一定的影響;受控環(huán)境沉降碟中微生物數(shù)量對(duì)比非受控環(huán)境明顯減少,可以觀察到明顯的單菌落,存在真菌;高受控環(huán)境沉降碟上菌落極少,甚至沒有,呈典型的細(xì)菌菌落形態(tài)。

2.2 潔凈環(huán)境分離菌形態(tài)觀察

為實(shí)驗(yàn)研究更具有代表性,除12株(編號(hào)S-)分離自上海海洋大學(xué)細(xì)胞房和生物安全柜受控環(huán)境菌株外,實(shí)驗(yàn)還采用62株(編號(hào)N-)實(shí)驗(yàn)室保存的來自藥廠潔凈環(huán)境的菌株(由上海諾狄生物科技公司分離自藥廠)。在純化培養(yǎng)時(shí),大部分細(xì)菌出現(xiàn)明顯的單菌落,但是有部分細(xì)菌呈根狀生長(zhǎng),或菌落較大,無法觀察到菌落形態(tài)。通過菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果,將細(xì)菌分為5組,米白色和黃色細(xì)菌較多,大多數(shù)細(xì)菌的邊緣整齊,結(jié)果如表3所示,根據(jù)菌落、菌體形態(tài),產(chǎn)芽孢桿菌主要在第3組和第4組。

表3 可培養(yǎng)細(xì)菌的表型特征Table 3 Phenotypic characteristics of culturable bacteria

2.3 生理生化鑒定

對(duì)革蘭氏陽性球菌進(jìn)行兔血漿凝固酶實(shí)驗(yàn),芽孢桿菌主要是革蘭氏陽性桿菌,對(duì)第3組、第4組進(jìn)行芽孢染色,分離出產(chǎn)芽孢桿菌,所得結(jié)果如表4所示。

表4 分離出的沉降菌分布構(gòu)成Table 4 Separation of sedimentation bacteria distribution

通過74株菌革蘭氏染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),革蘭氏陽性菌占90.54%,共檢出23株革蘭氏陽性桿菌,對(duì)其進(jìn)行芽孢染色,發(fā)現(xiàn)有14株產(chǎn)芽孢,占所有細(xì)菌的18.92%,占革蘭氏陽性陽性桿菌60.87%,說明產(chǎn)芽孢桿菌在潔凈環(huán)境中作為重要的污染菌存在。

對(duì)14株產(chǎn)芽孢細(xì)菌進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、V-P試驗(yàn)、水解、檸檬酸鹽、卵黃卵磷脂酶、溶菌酶耐性試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn),其生理生化特性如表5所示。

通過表5發(fā)現(xiàn),分離出菌株生理生化鑒定結(jié)果基本滿足芽孢桿菌生物學(xué)特征,為16S rDNA測(cè)序結(jié)果提供驗(yàn)證。

表5 14株芽孢桿菌生理生化鑒定Table 5 Physiological and biochemical identification of 14 strains of Bacillus

2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果,得到清晰明亮的單一條帶,且編碼基因大小相近,大約為1200 bp。因此可以初步判定該條帶即為目的基因片段。將純化得到的基因片段送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

由表6可知,14株產(chǎn)芽孢桿菌分為兩個(gè)屬,鑒別出5個(gè)不同種,有12株菌屬于芽孢桿菌屬,N-132、N-133為枯草芽孢桿菌;N-16、N-19為蠟樣芽孢桿菌;N-116為巨大芽孢桿菌,N-17蘇云金芽孢桿菌。N-015、N-018兩株屬于類芽孢桿菌屬,為解葡聚糖類芽孢桿菌,潔凈環(huán)境產(chǎn)芽孢菌株存在多樣性。

表6 16S rDNA鑒定結(jié)果Table 6 16S rDNA identification results

由圖3系統(tǒng)發(fā)育樹可知,N-015、N-018屬于同一分支,是類芽孢桿菌屬;S-13、S-20、N-06、N-016、N-11、N-16、N-17、N-19、N-115、N-116、N-132、N-133聚集于系統(tǒng)發(fā)育同一分支,其中,S-20、N-11、N-132、N-133、N-016同源性較近,N-16、N-17、N-19、N-115、N-06同源性較近。N-116與Bacillusmegateriumstrain SCSIO 43708,S-13與BacillussolaniDSS-STR-5同源性為100%,判斷N-116與Bacillusmegateriumstrain SCSIO 43708屬于同一種,S-13與BacillussolaniDSS-STR-5屬于同一種。

圖3 以潔凈環(huán)境產(chǎn)芽孢桿菌16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed with the spore-forming strains based on 16S rDNA gene sequence

2.5 耐藥性研究

14株產(chǎn)芽孢桿菌耐藥性如表7所示,不同來源的分離菌株對(duì)20種常見的抗生素呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性,其中,僅菌株N-016不存在耐藥性;潔凈環(huán)境分離的14株芽孢桿菌的耐藥率為92.86%。N-06、N-018、N-19、N-133對(duì)3類或3類以上抗菌藥物同時(shí)呈現(xiàn)耐藥的細(xì)菌多重耐藥率為21.4%。

表7 14株產(chǎn)芽孢桿菌耐藥性檢測(cè)Table 7 Detection of drug resistance of 14 strains of Bacillus

由表7分析,14株芽孢桿菌主要對(duì)青霉素類和頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生耐藥性,青霉素類和頭孢菌素類抗生素同屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素,在這14株產(chǎn)芽孢桿菌中,其中12株對(duì)青霉素不敏感,對(duì)青霉素耐藥率達(dá)85.71%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)74株不同受控潔凈環(huán)境(藥廠、超凈臺(tái)、細(xì)胞房)沉降菌檢測(cè),經(jīng)過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌占90.54%,共檢出23株革蘭氏陽性桿菌,有14株產(chǎn)芽孢,占所有細(xì)菌的18.92%,2株為類芽孢桿菌屬,12株為芽孢桿菌屬,為枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌;潔凈環(huán)境空氣來源的芽孢桿菌分離菌株92.86%具有耐藥性,其中部分菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。

研究表明,潔凈環(huán)境受產(chǎn)芽孢桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)性較高,且潔凈環(huán)境中產(chǎn)芽孢桿菌菌株存在多樣性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有較高的耐藥性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為潔凈環(huán)境中產(chǎn)芽孢菌株污染風(fēng)險(xiǎn)控制提供參考。