楊 薇,王巧云,鄧永東,吳學(xué)鳳,王華林,鄭 志,李興江,*

(1.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384; 2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

長(zhǎng)期以來(lái),谷物糧食一直都是乙醇生產(chǎn)的主要原料,而隨著人口的增長(zhǎng)和可利用資源的減少,尋找清潔可再生的新能源-生物質(zhì)乙醇受到了廣泛關(guān)注[1]。同時(shí),農(nóng)作物秸稈、木材、林業(yè)加工廢料和廢棄紙品等是主要的廢棄生物質(zhì)原料,每年大量的生物質(zhì)原料由于得不到充分利用而被舍棄。富含纖維素和半纖維素的生物質(zhì)是最有潛力的乙醇生產(chǎn)原料,其組成一般為:纖維素32%～41%,半纖維素36%～47%,木質(zhì)素14%～26%[2],并且纖維素原料是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源。因此,利用纖維素水解制糖,進(jìn)而生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇具有重要意義。

纖維素的主要水解產(chǎn)物是六碳糖(以葡萄糖為主)及五碳糖(以木糖為主)等,對(duì)葡萄糖和木糖的有效利用是生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一。葡萄糖是一種容易利用的碳源,大多數(shù)微生物都可以利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,而大多數(shù)微生物對(duì)木糖的利用率很低。研究報(bào)道,在利用木糖發(fā)酵的微生物中,發(fā)酵能力最強(qiáng)的是酵母,能夠利用戊糖發(fā)酵的三種酵母分別為管囊酵母(Pachysolentannophilus)、邏輯樹(shù)干畢赤酵母(Pichiastipitis)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis),充分利用纖維質(zhì)原料中的木糖,可使酒精的產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上增加25%甚至更高[3-4]。目前,研究主要涉及的是管囊酵母和邏輯樹(shù)干畢赤酵母五、六碳糖共發(fā)酵菌種的選育,管囊酵母、邏輯樹(shù)干畢赤酵母對(duì)酒精和抑制劑耐受度低,限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用[5],并且關(guān)于共發(fā)酵代謝分析方面目前也鮮有研究。

因此,本研究采用紫外誘變法對(duì)熱假絲酵母進(jìn)行選育,通過(guò)色譜法研究代謝通量,對(duì)其共發(fā)酵產(chǎn)酒精代謝分析開(kāi)展研究,以期為工業(yè)上纖維素廢棄原料的有效利用提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱帶假絲酵母CICC1779 合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工院保藏;其他試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;斜面培養(yǎng)基(1 L):葡萄糖20 g、酵母粉10 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g;液體培養(yǎng)基(1 L):葡萄糖20 g、酵母粉10 g、蛋白胨20 g;TTC 下層培養(yǎng)基(1 L):木糖10 g、蛋白胨2 g、酵母粉1.5 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.4 g、瓊脂30 g,pH5.5～5.7;TTC 上層培養(yǎng)基(1 L):木糖0.5 g、瓊脂1.5 g、TTC 0.05 g;發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L):葡萄糖30 g、木糖30 g、硫酸銨5 g、磷酸二氫鉀1 g、酵母膏1 g、七水硫酸鎂1 g。

756MC紫外分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MC酒精計(jì) 上海長(zhǎng)城儀器廠;WYT-4型手持糖量計(jì) 泉州中友光學(xué)儀器有限公司;RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海五相儀器儀表有限公司;Waters 2695 高效液相色譜儀 沃特斯科技(上海)有限公司;Agilent 7890A型氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選

1.2.1.1 紫外誘變 將熱帶假絲酵母CICC1779轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基上,于30 ℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為109CFU/mL。在磁力攪拌器作用下于紫外燈下(20 W、25 cm)分別照射20～80 s[6]。稀釋誘變后的菌液并涂布于木糖唯一碳源固體平板上,30 ℃避光培養(yǎng)2 d[7]。然后挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株,接種到以濃度為200 g/L的木糖為唯一碳源篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2 d。

1.2.1.2 初篩 配制木糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌(121 ℃,20 min),用移液槍將培養(yǎng)液加到杜氏小管至10 mL,迅速將杜氏小管倒入試管中,在固體培養(yǎng)基中沾取少許菌落,放入試管中攪拌,用封口膜封口,并放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,觀察杜氏小管中的氣泡情況[8],選取產(chǎn)氣較多的突變株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.1.3 復(fù)篩 在木糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)初篩單菌落,待菌落長(zhǎng)出后在其上面倒入TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)選擇培養(yǎng)基,陰暗處30 ℃恒溫培養(yǎng)2 h,觀察選擇培養(yǎng)基內(nèi)各個(gè)菌落的顏色,挑選出顏色較紅的菌落用于后續(xù)研究[9]。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及種子液的制備 將篩選得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基,每隔2 h在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定其OD值,確定其生長(zhǎng)曲線。然后再培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,制備成種子液備用。

1.2.3 發(fā)酵工藝 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液接種至121 ℃滅菌15 min的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵,發(fā)酵溫度設(shè)定為34 ℃,初始pH調(diào)節(jié)到4。發(fā)酵96 h[10]。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定方法 糖含量測(cè)定采用液相色譜法[11];色譜條件:Waters Carbohydrate Analysis Column(3.9 mm×300 mm)色譜柱;流動(dòng)相為80%乙腈-20%水,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。超聲脫氣30 min,進(jìn)樣量為20 μL,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃。根據(jù)外標(biāo)法定量計(jì)算樣品中糖含量,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.67143x-0.00524,R2=0.996,在0～0.1 mg/mL的范圍內(nèi)線性良好;木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.53995x+0.02194,R2=0.993,在0～0.2 mg/mL的范圍內(nèi)線性良好。

乙醇含量的測(cè)定采用氣相色譜法[12],檢測(cè)條件:色譜柱為ZB-624,柱溫100 ℃(1 min),15 ℃/min,190 ℃(3 min);柱流量為高純氮30 mL/min(恒流);氣體流量為氫氣400 mL/min,空氣400 mL/min;進(jìn)樣口200 ℃;檢測(cè)器250 ℃。根據(jù)外標(biāo)法定量計(jì)算樣品中乙醇含量,乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=13.01x-0.223,R2=0.998,在乙醇和正丙醇之比在1∶2的范圍內(nèi)線性良好。

菌體重量采用恒溫干燥法測(cè)量:將濾紙于105 ℃下烘干至恒重,取100 mL 樣品液于6000 r/min離心10 min,去上清液,將沉淀用蒸餾水洗滌2～3次后置于80 ℃烘干至恒重稱量,計(jì)算菌體干重。

1.2.5 代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及流量分析 代謝通量分析是進(jìn)行計(jì)算細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物流量分布的有效分析手段,是在擬穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)上來(lái)進(jìn)行計(jì)算的,即假定段時(shí)間內(nèi)中間體的量不變,計(jì)算公式為:

r=GTV

其中,向量r為代謝物凈形成速率(mmol/(g DW·h)),V為內(nèi)部反應(yīng)速率(mmol/(g DW·h))。G為總化學(xué)計(jì)量矩陣用于所有反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物。代謝通過(guò)EXCEL 2007的MMULT和MINVERSE進(jìn)行計(jì)算[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Design expert 8.0.6.1和Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變菌株篩選結(jié)果

2.1.1 突變菌株初篩結(jié)果 酵母菌產(chǎn)氣的時(shí)間越早,產(chǎn)氣量越多,代表酵母菌的發(fā)酵性能越好。在進(jìn)行酵母菌研究時(shí),應(yīng)選取產(chǎn)氣量較多的酵母菌。表1顯示的是突變菌的杜氏小管產(chǎn)氣表。由表1可知,在誘變的菌株中,產(chǎn)氣泡最多的六種菌株的編號(hào)分別是T70-2、T110-1、T30-1、T50-1、T70-3和T90-2。選擇這六株產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行下一步的篩選。

表1 杜氏小管產(chǎn)氣結(jié)果Table 1 The results of Dushi tube gas production

2.1.2 突變菌株復(fù)篩結(jié)果 突變菌株的復(fù)篩單菌落如圖1所示。TTC(2,3,5.氯化三苯基四氮唑)是一種與酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑,通過(guò)它可以判斷酵母呼吸酶活力的大小,間接反映酵母產(chǎn)酒精能力的高低。在培養(yǎng)基上的酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑,菌落會(huì)顯示不同的顏色,產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母會(huì)顯現(xiàn)深紅色,次之為粉紅色、微紅色或不顯色[15-16]。從圖1中篩選出最紅的單菌落(T70-2)作為后面研究的菌株,并將此菌株命名為:熱帶假絲酵母 CICC1779-T70-2。

圖1 TTC顯色單菌落圖Fig.1 Single colony map of TTC coloration

2.2 原始菌和突變菌生長(zhǎng)曲線對(duì)比分析

原始菌和突變菌的生長(zhǎng)曲線如圖2,由圖2(A)可知,原始菌株在以葡萄糖為唯一碳源的條件下能較好生長(zhǎng),且呈現(xiàn)良好的S型生長(zhǎng)曲線,在13 h附近達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此時(shí)菌體生長(zhǎng)最為旺盛,在20 h 左右達(dá)到最大OD值1.6,隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。但在以木糖為唯一碳源條件下生長(zhǎng)緩慢,無(wú)明顯的對(duì)數(shù)期,其最大OD值只能達(dá)到以葡萄糖為碳源條件下的1/3(0.6),說(shuō)明相比葡萄糖,原始菌對(duì)木糖的適應(yīng)性較差,在以木糖為唯一碳源條件下不能較好生長(zhǎng)。

經(jīng)過(guò)突變篩選得到的菌株其生長(zhǎng)曲線如2(B)所示。由圖2(B)可知,突變菌株在以葡萄糖為唯一碳源的條件下依舊能較好生長(zhǎng),呈現(xiàn)良好的S型生長(zhǎng)曲線。在10 h附近達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,相比較原始菌提前了3 h,其最大OD值和原始菌相似,保持在1.6左右。突變菌在以木糖為唯一碳源條件下也能較好生長(zhǎng),在12 h附近進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,滯后于以葡萄糖為碳源條件下的時(shí)間。其最大OD值約為1.1,相比較原始菌以木糖為碳源條件下有明顯提升。

圖2 原始菌(A)和突變菌(B)生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of the original and mutant strain

2.3 原始菌和突變菌發(fā)酵結(jié)果對(duì)比分析

圖3表示原始菌株和突變菌株發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度(a)、木糖濃度(b)、菌體濃度(c)和乙醇濃度(d)的變化情況。由圖3(a)可知,葡萄糖濃度整體下降的比較明顯,原始菌株和突變菌株對(duì)葡萄糖的利用情況都較好,在72 h時(shí)利用率利用率分別接近95%、96%。由圖3(b)可知,原始菌株和突變菌株對(duì)木糖的利用率有明顯差別。原始菌株發(fā)酵時(shí),木糖的濃度在前24 h下降緩慢,24～72 h下降速度較快,在72 h之后木糖含量趨于穩(wěn)定,其殘?zhí)橇拷咏?3.25 g/L,木糖的利用率只能達(dá)到55.8%;突變菌株發(fā)酵時(shí),木糖濃度整體下降速度較快,木糖在36 h之后也呈現(xiàn)較快下降趨勢(shì),72 h木糖濃度僅為5.16 g/L,在84 h左右趨于穩(wěn)定,其殘?zhí)橇拷咏?.32 g/L,木糖的利用率達(dá)到92.2%。隨著對(duì)葡萄糖和木糖的代謝分解,菌體開(kāi)始大量繁殖,原始菌和突變菌的菌體濃度都開(kāi)始上升,如圖3(c)所示;菌體代謝葡萄糖、木糖,乙醇濃度開(kāi)始上升,突變菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇濃度在72 h時(shí)達(dá)到最大濃度22.85 g/L,但由于原始菌對(duì)木糖的利用率較低,乙醇產(chǎn)量最終也只有17.58 g/L,說(shuō)明此突變菌對(duì)比原始菌,對(duì)木糖的利用轉(zhuǎn)化率有較大提高。

圖3 原始菌和突變菌發(fā)酵過(guò)程中成分濃度變化Fig.3 Variations in the concentration of components of the original and mutant strain during fermentation process

2.4 突變菌共代謝流量分析

圖4為酵母菌五、六碳糖的代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝方程,表2給出了各個(gè)關(guān)鍵酶中間體的催化過(guò)程,表3列出32個(gè)節(jié)點(diǎn)的流量方程式。其中方程式1～19依據(jù)的是代謝體物質(zhì)的量平衡公式,方程式20～28的系數(shù)常量依據(jù)參考文獻(xiàn)[17-18]。底物輸入、產(chǎn)物輸出、細(xì)胞生成量都是直接檢測(cè)的。細(xì)胞生物量在60～72 h接近平衡,特別選擇此時(shí)期進(jìn)行代謝通量分析。整體通量數(shù)據(jù)有32個(gè)未知量對(duì)應(yīng)32個(gè)反應(yīng)式,通過(guò)EXCEL 2007矩陣計(jì)算得到通量結(jié)果,結(jié)果如表4所示。

圖4 突變菌株代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Metabolic network of mutant strains

表2 突變菌株代謝反應(yīng)Table 2 Metabolic reactions of mutant strains

續(xù)表

表3 突變菌株代謝方程Table 3 Metabolic equation of mutant strain

表4 突變菌株代謝流量數(shù)值表(mmol/(g DW·h))Table 4 Metabolic flux values of mutant strains(mmol/(g DW·h))

原始菌株和突變菌株的代謝流量見(jiàn)表4,輸入底物與產(chǎn)物通量變化與葡萄糖、木糖的消耗變化以及乙醇產(chǎn)量變化相吻合。由表4可知,突變菌株整體的代謝流量明顯高于原始菌株,尤其在幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)木糖的消耗流量明顯加快,從J5到J6再到J7、J8的流量增大,說(shuō)明了突變菌株對(duì)木糖的代謝增強(qiáng),同時(shí)丙酮酸流向乙醛的流量也顯著增加,J21和J22流量的增大,充分說(shuō)明了突變菌株有更多的流量流向了乙醇,乙醇產(chǎn)量顯著提升。原始菌不能有效代謝木糖,是由于其缺乏木桐糖酶,無(wú)法將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇,戊糖磷酸途徑無(wú)法順利進(jìn)行[19]。突變菌對(duì)木糖的代謝能力明顯增強(qiáng),主要是由于突變菌株可以提供木桐糖酶,保證了戊糖磷酸途徑J5、J6、J7的順利進(jìn)行,使突變菌株更能適應(yīng)木糖環(huán)境下的生長(zhǎng)和代謝,提高了突變菌株對(duì)木糖的利用率,增加了乙醇的產(chǎn)率。本文通過(guò)原始菌和突變菌對(duì)葡萄糖和木糖代謝的內(nèi)部流量分析,更加清晰地探究了其發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)路徑的代謝和流量走向,為以后流量的進(jìn)一步控制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

原始酵母菌對(duì)木糖的利用率一直較低,大量的生物質(zhì)原料得不到充分利用造成嚴(yán)重浪費(fèi)。本文對(duì)熱帶假絲酵母進(jìn)行誘變篩選,獲得一株能利用木糖發(fā)酵的菌株:熱帶假絲酵母 CICC1779-T70-2。通過(guò)對(duì)原始菌和突變菌發(fā)酵成分指標(biāo)檢測(cè)對(duì)比分析可知,原始菌株對(duì)木糖的利用率僅為55.8%,而突變菌株的木糖利用率為92.2%;突變菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇濃度最高可達(dá)22.85 g/L,而原始菌乙醇的產(chǎn)量最終只有17.58 g/L。進(jìn)而對(duì)突變菌代謝機(jī)理深入研究,構(gòu)建酵母菌代謝網(wǎng)絡(luò)并建立方程,對(duì)其代謝流量進(jìn)行分析可知,原始菌不能有效代謝木糖是由于其缺乏木桐糖酶,無(wú)法將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇,戊糖磷酸途徑無(wú)法順利進(jìn)行,突變菌可以提供木桐糖酶,保證了戊糖磷酸途徑的順利進(jìn)行,提高了突變菌株對(duì)木糖的利用率,增加了乙醇的產(chǎn)率。本文深入探究分析酵母菌對(duì)五碳糖和六碳糖的共代謝,為后續(xù)的放大生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。