趙 彤,王永霞,荀一萍,艾連中,趙林森,王立峰,朱 宏,王世杰

(1.河北工程大學(xué),河北邯鄲 056001; 2.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司,河北石家莊 050221; 3.上海理工大學(xué),上海 200093; 4. 河北一然生物科技有限公司,河北石家莊 050800; 5. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué),江蘇南京 210046)

益生菌被定義為“當(dāng)攝入足夠數(shù)量時(shí),對(duì)宿主有健康作用”的活的微生物[1]。其可通過(guò)改善免疫應(yīng)答,產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和益生物質(zhì)來(lái)發(fā)揮益生作用[2]。目前研究較多的益生菌為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬,尤其是乳桿菌屬,其作為口腔及腸道內(nèi)最常見(jiàn)的微生物菌群,能夠顯著抑制有害菌的生長(zhǎng),被認(rèn)為是一種具有應(yīng)用價(jià)值的益生菌[3-5]。篩選益生菌除了要考慮功能性外,還應(yīng)考慮安全性,而研究益生菌的體內(nèi)活性成本高且費(fèi)時(shí),因此一般采取體外實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株益生活性進(jìn)行研究。

發(fā)酵食品是獲得優(yōu)質(zhì)益生菌的重要來(lái)源之一,如酸菜、開(kāi)菲爾、奶酪等均可分離獲得具有潛在應(yīng)用價(jià)值的益生菌[6-7]。開(kāi)菲爾乳桿菌是開(kāi)菲爾發(fā)酵乳中的主要組成之一,具有悠久的食用歷史。近年來(lái)對(duì)開(kāi)菲爾乳桿菌的研究發(fā)現(xiàn),其具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制有害菌等多種益生作用[8-9]。而國(guó)內(nèi)對(duì)于開(kāi)菲爾乳桿菌的研究也在逐漸增多,主要側(cè)重于開(kāi)菲爾乳桿菌的分離和開(kāi)菲爾粒中復(fù)合菌株發(fā)酵乳的研究[10-11]。本研究前期從波蘭開(kāi)菲爾粒中分離獲得一株開(kāi)菲爾乳桿菌KL22,具有較好的耐酸能力、耐膽鹽能力、粘附能力等,現(xiàn)對(duì)其體外疏水性、自凝聚力、降膽固醇能力、抗生素敏感性等進(jìn)行研究,旨在確定其益生特性,為開(kāi)發(fā)安全多功能益生菌和微生物制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

開(kāi)菲爾乳桿菌KL22 本實(shí)驗(yàn)室從開(kāi)菲爾粒樣品中分離保藏,中科院微生物研究所鑒定保存,專利保藏號(hào)CGMCC9669;人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株 由四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院提供,液氮保存;TC含量測(cè)定試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real Time PCR試劑盒 天根生化科技有限公司;抗生素標(biāo)準(zhǔn)品(具體見(jiàn)1.2.8) 中國(guó)食品藥品鑒定研究所提供。

SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CX31顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社;冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司;生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技有限公司;倒置顯微鏡 株式會(huì)社尼康;pH計(jì) 梅特勒-托利多集團(tuán);紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及菌懸液的制備

1.2.1.1 MRS改良培養(yǎng)基的制備 葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、牛肉浸粉0.5%、無(wú)水乙酸鈉0.5%、C6H17N3O70.2%、K2HPO4·3H2O 0.2%、吐溫-80 0.1%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025%、瓊脂1.5%,pH調(diào)為6.2,121 ℃,15 min滅菌。

1.2.1.2 含膽固醇改良MRS液體培養(yǎng)基(改良MRS-CHOL)的制備 精確稱取膽固醇0.1 g,用少量無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL,終濃度為10 mg/mL,用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后,按照1%的量加入到改良MRS液體培養(yǎng)基中,使其膽固醇終濃度為0.1 mg/mL。

1.2.1.3 DMEM完全培養(yǎng)液的制備 90% DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、1%青-鏈霉素,混合均勻。

1.2.1.4 菌懸液的制備 將KL22按1%接種量轉(zhuǎn)接于改良MRS培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2代后用PBS洗滌并調(diào)整菌濃度至106～108CFU/mL;滅活組為95 ℃水浴10 min[12]。

1.2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將KL22按2%的接種量接種到50 mL的改良MRS培養(yǎng)基中,于37 ℃靜置培養(yǎng),每隔4 h取出3 mL菌液,測(cè)定在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,另以未接種的滅菌改良MRS培養(yǎng)基為吸光度測(cè)定的空白液。平行測(cè)定3次,取平均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線[13]。

1.2.3 菌株的產(chǎn)酸能力測(cè)定 將轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2次的KL22接種于改良MRS培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng),每隔4 h測(cè)定培養(yǎng)液的pH,平行測(cè)定3次,取平均值[14]。

1.2.4 菌株表面疏水性的測(cè)定 用BATH(碳烴化合物黏著法)對(duì)菌株表面疏水性進(jìn)行測(cè)定:將KL22轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2次,取5 mL菌液于6000 r/min離心10 min,收集菌體。以5 mL PBS緩沖液洗滌菌體2次,以PBS緩沖液為空白對(duì)照,調(diào)整菌懸液濃度至OD600值約為0.50左右,記為A0。取3組3 mL調(diào)整好濃度的菌液分別置于10 mL無(wú)菌離心管,加入1 mL不同的有機(jī)溶劑(3組分別為二甲苯、三氯甲烷和乙酸乙酯),室溫靜置5 min,旋渦振蕩2 min,室溫繼續(xù)靜置30 min,待液相分層后取水相,測(cè)OD600值,記為A1。按下列公式計(jì)算菌株表面疏水性[15]。重復(fù)3次,取平均值。

細(xì)胞表面疏水性H(%)=(A0-A1)/A0×100

1.2.5 菌株自凝聚力的測(cè)定 將KL22轉(zhuǎn)接培養(yǎng)2次,取5 mL菌液于6000 r/min離心10 min,收集菌體,10 mL PBS洗滌2次后重懸。以PBS為空白對(duì)照,調(diào)整菌懸液濃度至OD600值約為1.00。取4 mL調(diào)整好濃度的菌懸液于離心管中,室溫靜置,分別在靜置1、2、3、4、5 h后吸取3 mL上層溶液測(cè)定600 nm吸光值,分別記為A1、A2、A3、A4和A5,按下列公式計(jì)算菌株自凝聚能力[16]。重復(fù)3次,取平均值。

菌株自凝聚能力(%)=[1-(At/A0)]×100

式中：A0和At分別是自凝聚前后上清液在600 nm下測(cè)定的吸光度值。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.2.6 菌株降膽固醇能力的測(cè)定 將KL22于37 ℃培養(yǎng)36 h,OD600處測(cè)定菌懸液的吸光值。PBS洗滌1次,收集菌體。滅活組為95 ℃水浴10 min。后取2 mL改良MRS-CHOL重懸菌體,加到9 mL改良MRS-CHOL中,于37 ℃下厭氧培養(yǎng)24、48 h。另做無(wú)菌改良MRS-CHOL對(duì)照[12]。培養(yǎng)完成后,9000 r/min離心10 min,收集上清,參照TC含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.2.7 菌株誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 細(xì)胞與菌體共培養(yǎng) 將1 mL液氮凍存的Caco-2細(xì)胞(細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL)接種于DMEM完全培養(yǎng)液,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),待Caco-2細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí),去除培養(yǎng)液。用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整KL22的菌濃度分別為106、108CFU/mL,后與Caco-2細(xì)胞在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 h,用無(wú)菌PBS對(duì)實(shí)驗(yàn)組(KL22作用)和對(duì)照組(無(wú)KL22作用)的Caco-2細(xì)胞沖洗2次,收集細(xì)胞[17]。參照總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取Caco-2細(xì)胞總RNA。

1.2.7.2 引物設(shè)計(jì) 免疫相關(guān)基因IL-8、TNF-α、BD-2和內(nèi)參基因gapdh由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成[17]。

1.2.7.3 Real Time PCR反應(yīng)條件 參照天根生化科技有限公司KR106說(shuō)明書(shū),將所提取的Caco-2細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。后參照天根生化科技有限公司FP205說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。

1.2.7.4 結(jié)果分析 每個(gè)待測(cè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)待檢基因的Ct值,利用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,計(jì)算當(dāng)結(jié)果大于1時(shí)，則認(rèn)為上調(diào)了基因的表達(dá)量，當(dāng)結(jié)果等于1時(shí)，則認(rèn)為基因的表達(dá)量未發(fā)生變化，當(dāng)結(jié)果小于1時(shí)，則認(rèn)為下調(diào)了基因的表達(dá)量[18]。

2-ΔΔCt=2-[(Ct gene of interest-Ct internal control)sample A-(Ct gene of interest-Ct internal control)sample B]

1.2.8 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用K-B法測(cè)定了菌種對(duì)30種抗生素的敏感性[19]。將活化的菌液在固體MRS培養(yǎng)基上劃線后37 ℃進(jìn)行培養(yǎng),挑取單菌落于生理鹽水中,稀釋到濃度為0.5 McFarland濁度(相當(dāng)于所接種的菌量為1×108CFU/mL)。取300 μL上述菌懸液在整個(gè)Mueller Hinton培養(yǎng)基表面進(jìn)行涂布,待培養(yǎng)基表面的菌液完全晾干后,貼上抗生素紙片,置于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),然后測(cè)量抑菌圈的直徑。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定為耐藥(resistant)、中介(intermediate)、以及敏感(sensitive)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 KL22生長(zhǎng)曲線繪制結(jié)果

為確保實(shí)驗(yàn)用菌株的質(zhì)量,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),菌液OD600值為縱坐標(biāo)繪制了KL22的生長(zhǎng)曲線,如圖1。

圖1 KL22的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of strain

由圖1可看出,菌株KL22的曲線可分為3個(gè)階段:延遲期為0～8 h,此時(shí)期的菌株數(shù)目增加不明顯;對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為8～76 h,經(jīng)延遲期的準(zhǔn)備,為菌株的生長(zhǎng)提供了足夠的物質(zhì)基礎(chǔ),同時(shí),外界環(huán)境也是最佳狀態(tài),因此,在此時(shí)間段菌株KL22增殖迅速;76 h后菌株進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期[13]。因此,選取培養(yǎng)8～76 h的KL22進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 KL22產(chǎn)酸能力分析

產(chǎn)酸能力是篩選乳酸菌的一個(gè)重要指標(biāo),發(fā)酵所產(chǎn)的乳酸能夠賦予乳制品特征性的酸味,因此,菌株的產(chǎn)酸性能越強(qiáng),說(shuō)明其性能越佳[14]。此外,在酸性條件下,可抑制李斯特桿菌、沙門(mén)氏菌等致病菌的生長(zhǎng)[20]。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),培養(yǎng)基pH為縱坐標(biāo)繪制KL22的產(chǎn)酸曲線,如圖2所示。

圖2 菌株KL22的產(chǎn)酸能力與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Relationship between acid-producing ability and culture time of strain KL22

由圖2可知,菌株KL22的發(fā)酵液pH隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先迅速下降后趨于平緩的特點(diǎn)。在培養(yǎng)0～8 h時(shí)幾乎無(wú)變化,在8～76 h時(shí),發(fā)酵液的pH開(kāi)始快速下降,該時(shí)期菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌株快速繁殖,故開(kāi)始大量代謝酸性物質(zhì)。培養(yǎng)76 h后,菌株的pH基本保持穩(wěn)定,為4.3左右,這與菌株處于穩(wěn)定期有一定關(guān)系。

2.3 KL22的疏水性分析

過(guò)菌懸液和有機(jī)溶劑(包括二甲苯、三氯甲烷和乙酸乙酯)的混合、振蕩和靜置,對(duì)菌株進(jìn)行表面疏水性測(cè)定。由圖3a知,菌株的油水分層較為清楚,菌株與二甲苯混合的結(jié)果明顯比三氯甲烷的要渾濁,這與測(cè)定的疏水性相符,而菌株與乙酸乙酯混合的分層效果較其它兩種有機(jī)溶劑要差,其疏水性也要差一些。

圖3 KL22疏水性測(cè)定結(jié)果Fig.3 Cell surface hydrophobicity of KL22

在益生菌體外篩選中,菌體表面疏水性的大小反映菌體在體內(nèi)定植的能力強(qiáng)弱[15]。由圖3b可知,KL22對(duì)三種有機(jī)溶劑都有一定的細(xì)胞表面疏水能力,但疏水結(jié)果有所不同。其中,對(duì)三氯甲烷的吸附能力最強(qiáng),高達(dá)98.5%,對(duì)二甲苯的吸附能力高于對(duì)乙酸乙酯的吸附能力,分別為91.62%和82.64%。與閆劉慧[21]研究的5株乳酸菌相比,KL22的疏水性均高于K4H3、K4H2、K3H1等,表明KL22具有較高的疏水性,具有在腸道細(xì)胞表面定植的潛力。

2.4 KL22的自凝聚能力分析

對(duì)菌株自凝集率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4a,菌株在靜置時(shí)間下OD600值的變化見(jiàn)圖4b,將圖4a和4b結(jié)合,可以更加直觀地看出,菌株的OD600值隨著靜置時(shí)間的增加呈現(xiàn)出下降趨勢(shì),而菌液自凝集率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。菌液自凝集率的上升趨勢(shì)并不是一條直線,在1 h內(nèi),自凝集率最強(qiáng),振蕩后明顯沉降。1 h后,KL22的自凝集率達(dá)到17.18%,在5 h后,自凝聚率達(dá)到21.17%。夏海燕[16]研究了4株乳酸菌的自凝聚能力,結(jié)果表明,接種4 h后的自凝聚率范圍為7.2%～28.1%。另有研究表明,菌株的自凝聚能力對(duì)形成生物膜有重要影響,與腸道定植密切相關(guān)[20]。

圖4 KL22的自凝聚能力Fig.4 Auto-aggregation of KL22

2.5 KL22的降膽固醇能力分析

將KL22接種于含有10 mg/mL膽固醇的改良MRS培養(yǎng)基中,測(cè)定其膽固醇的降解率,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 KL22對(duì)膽固醇降解率Fig.5 The result of degradation rate of cholestrolo

由圖5可知,24、48 h作用時(shí)間均有一定的降膽固醇能力,24 h的降膽固醇能力較48 h要弱?；罹鸂顟B(tài)的KL22作用48 h后的膽固醇降解率最高,達(dá)到52.94%,滅活狀態(tài)作用48 h和滅火狀態(tài)作用24 h次之,膽固醇降解率分別為35.79%和27.96%,活菌狀態(tài)作用24 h最低,為16.93%。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中,膽固醇降解率達(dá)到40%以上的菌株寥寥無(wú)幾,由此得出KL22的膽固醇降解能力較強(qiáng)[22]。對(duì)于益生菌降膽固醇機(jī)理,近年來(lái)各學(xué)者進(jìn)行了較多的研究,主要集中在吸收同化理論、共沉淀理論和其他理論[12],實(shí)驗(yàn)菌株KL22對(duì)膽固醇的降解能力基于何種機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.6 KL22誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中基因在mRNA水平上的表達(dá)變化

細(xì)胞因子是一類(lèi)可參與免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽[23]。本實(shí)驗(yàn)以Caco-2細(xì)胞為模型,并通過(guò)2-ΔΔCt法分析KL22作用于Caco-2細(xì)胞后免疫相關(guān)因子的表達(dá)量變化,結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知,當(dāng)菌懸液濃度為108CFU/mL時(shí),上調(diào)了IL-8和TNF-α基因的表達(dá)水平,然而下調(diào)了BD-2基因的表達(dá)水平。另外,當(dāng)菌懸液濃度為106CFU/mL時(shí),會(huì)下調(diào)IL-8、TNF-α和BD-2在Caco-2細(xì)胞中的表達(dá)。其中,IL-8是一種趨化因子,TNF-α是一種促炎性細(xì)胞因子,在參與和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、維持機(jī)體正常免疫生理狀態(tài)等方面發(fā)揮著重要的作用;BD-2是一種具有廣譜抗菌的多肽,被激活后發(fā)揮抗菌防御作用,使機(jī)體的保護(hù)性因子,在免疫性疾病組織中高表達(dá),而在非炎性機(jī)體中低表達(dá)[24]。以上結(jié)果表明,菌株KL22可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)或免疫細(xì)胞表達(dá)不同類(lèi)型的細(xì)胞因子,進(jìn)而提高宿主免疫力[23],且兩種菌液濃度均未上調(diào)BD-2的表達(dá),說(shuō)明KL22不會(huì)引起Caco-2細(xì)胞的抗菌排斥反應(yīng),可見(jiàn)KL22在抵抗炎癥和抵抗腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等方面具有一定的潛力。

表2 KL22誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中IL-8、TNF-α和BD-2基因的表達(dá)Table 2 KL22 induced gene expressions of IL-8,TNF-α and BD-2

2.7 抗生素敏感性

抗生素敏感性是分析菌株在應(yīng)用中安全使用的重要特征。因此,采用改良K-B法對(duì)KL22進(jìn)行了抗生素敏感試驗(yàn),結(jié)果以美國(guó)CLSI文件的最新版本執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定,如表3所示。

表3 抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of antibiotic susceptibility test of KL22

從表3可以看出,在對(duì)抗生素的藥敏性試驗(yàn)中,菌株KL22對(duì)25種抗生素均敏感(S);對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)為中度敏感(M);對(duì)環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明和苯唑西林表現(xiàn)出抗性(R)?？梢?jiàn),KL22的安全風(fēng)險(xiǎn)較低。抗生素是一種生理活性物質(zhì),其抗菌活性主要表現(xiàn)在三種現(xiàn)象:抗菌、殺菌和溶解[25]。對(duì)細(xì)菌的殺菌作用表現(xiàn)在對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的強(qiáng)氧化作用以及核酸和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的破壞。益生菌的使用要避免耐藥基因的傳播,如果抗性基因不能進(jìn)行轉(zhuǎn)移,菌株即可引進(jìn)市場(chǎng)[26]。此外,針對(duì)上述四種抗生素抗性現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制,仍需要進(jìn)一步研究分析,可能有助于益生菌在抗生素使用方面的應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究從分離自波蘭開(kāi)菲爾粒的L.kefiriKL22入手,通過(guò)比濁法和跟蹤pH確定其生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線;通過(guò)菌株的益生特性研究,表明KL22具有較好的疏水性和自聚合能力;通過(guò)體外降膽固醇實(shí)驗(yàn),表明KL22的膽固醇降解率在16.93%～52.94%。此外,KL22能夠通過(guò)調(diào)整細(xì)胞因子的表達(dá)量,進(jìn)而在機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮作用;在抗生素敏感方面,KL22對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)為中度敏感(M),對(duì)環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明和苯唑西林表現(xiàn)出抗性(R),對(duì)其它25種抗生素均表現(xiàn)出敏感(S)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)的受試菌株KL22具有較好的疏水性、抑制有害菌粘附作用、抗氧化性、降膽固醇能力,并可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)量,具有作為益生菌的良好潛質(zhì)和應(yīng)用前景。

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