李 婕,黃琳翔,詹藝舒,褚秀丹,肖淑霞,陳炳智,3,江玉姬,3,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002; 2.福建省食用菌技術(shù)推廣總站,福建福州 350002; 3.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建福州 350002)

雙孢蘑菇Agaricusbisporus(J.E. Lange)Imbach是世界上栽培最廣、產(chǎn)量最多的一種食用菌[1],其顏色潔白,味道鮮美,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健效果。因?yàn)殡p孢蘑菇含水量較多、呼吸速率高,難以貯藏保鮮,極易褐變和發(fā)生由微生物引起的腐爛現(xiàn)象[2],限制了雙孢蘑菇的鮮銷(xiāo),因此,雙孢蘑菇貯藏期間的品質(zhì)變化及其保藏方法研究尤為重要。李靜[3]和李云云[4]等分別采用低溫下二氧化碳、乙醇熏蒸和低鹽真空處理對(duì)雙孢蘑菇進(jìn)行保鮮試驗(yàn),結(jié)果表明:雙孢蘑菇的保鮮期均有所延長(zhǎng)。目前研究主要集中于雙孢蘑菇的褐變機(jī)理及采后保鮮技術(shù),而對(duì)保鮮過(guò)程中微生物菌相變化的研究則未見(jiàn)報(bào)道。

長(zhǎng)期以來(lái),研究者們大都以微生物的傳統(tǒng)純培養(yǎng)為基礎(chǔ),從各種食品中分離純化鑒定了多種微生物[5]。但是由于培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件的限制,通過(guò)傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法分離純化出來(lái)的微生物,卻僅占環(huán)境中微生物的極小部分[6]。隨著現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的普及,高通量測(cè)序技術(shù)已成功應(yīng)用于土壤多樣化[7]、海洋食品[8]和腸道環(huán)境[9]、發(fā)酵食品[10]等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域,可檢測(cè)到食品中更多的微生物群落,及時(shí)了解時(shí)空演替規(guī)律,其中16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于食品微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域[11]。劉延波等[12]通過(guò)Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)濃香型白酒中溫曲和高溫曲進(jìn)行高通量測(cè)序分析,鑒定出不同類(lèi)型酒曲中的特殊細(xì)菌,建立了一套分析濃香型白酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的高通量測(cè)序方法。Park等[13]在10種泡菜的發(fā)酵過(guò)程中定期收集了100份樣品,采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)影響泡菜生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的因素進(jìn)行分析,結(jié)果表明:每種泡菜的種類(lèi)和制作工藝不同,相應(yīng)的細(xì)菌群落多樣性和豐富程度有所不同。本研究將傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)法與宏基因組(16S rRNA基因)測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,測(cè)定雙孢蘑菇在4 ℃貯藏保鮮條件下的表面微生物群落的變化和優(yōu)勢(shì)菌,為雙孢蘑菇的保鮮提供參考數(shù)據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雙孢蘑菇 采自福建省長(zhǎng)樂(lè)市鶴上鎮(zhèn)新覽村希爾帆食用菌工程技術(shù)研究中心;LB固體培養(yǎng)基(蛋白胨、酵母膏粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

BIORAD S1000 Thermal Cycler PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-12C型電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng);SPX-80A-JB型恒溫生化培養(yǎng)箱 上海一恒實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將當(dāng)天新鮮采摘的雙孢蘑菇進(jìn)行分揀,挑選菇體完整、顏色潔白、未開(kāi)傘、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷、子實(shí)體大小基本一致的雙孢蘑菇隨機(jī)分成4組,每組80±5.0 g,置于4 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)保鮮,從第0 d開(kāi)始,每4 d取一次樣,編號(hào)分別為S0、S1、S2、S3。采樣原則、采樣方案參照GB/T 4789.1-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》。

1.2.2 平板分離 將不同保鮮時(shí)期的雙孢蘑菇表面組織切塊(約1 cm×1 cm),稱(chēng)取25.0 g于無(wú)菌袋中,加入225.0 mL蛋白胨水,均勻振蕩30 s,獲得外源細(xì)菌的洗脫液,制備10倍系列稀釋樣品勻液,取100 μL稀釋液均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀(guān)察菌落形態(tài)特征,挑取不同形態(tài)特征的菌落進(jìn)行2～3次分離純化,純化后的菌株保存于試管斜面,備用。顯微鏡檢其形態(tài)以及革蘭氏染色。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 用接種環(huán)依次挑取每個(gè)純培養(yǎng)后的菌株,于裝有10 μL滅菌蛋白胨水的離心管內(nèi)制備菌懸液作為DNA模板,利用細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用30 μL體系:DNA模板1 μL、10×Buffer 3 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物各1 μL、rTaq酶0.3 μL、滅菌雙蒸水22 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)到目標(biāo)條帶后,將PCR產(chǎn)物送于上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì),找到相似度最高的菌種。

1.2.4 Illumina Miseq高通量測(cè)序分析 雙孢蘑菇樣品在干冰條件下送至上海生工生物公司,提取菇體表面DNA,針對(duì)16S rRNA基因V3～V4區(qū),合成帶有barcode的特異引物。利用341F(5′-CCTACGGG NGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGG TATCTAATCC-3′)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析,將測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行篩選,丟棄長(zhǎng)度短于200 bp、對(duì)低復(fù)雜度的序列進(jìn)行過(guò)濾,得到質(zhì)量較高、符合要求的有效序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將各樣本序列進(jìn)行質(zhì)量控制過(guò)濾后,對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTU)聚類(lèi),并利用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)信息分析,分析樣品物種組成。利Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性和基于加權(quán)Unifrac算法進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。利用 RDP classifier軟件對(duì)各樣品中OTU依次進(jìn)行門(mén)(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)分類(lèi)信息分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏時(shí)間對(duì)菇體表面細(xì)菌總數(shù)的影響

不同貯藏時(shí)間對(duì)雙孢蘑菇菇體表面的細(xì)菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1,可以看出,新鮮采收的雙孢蘑菇表面菌落總數(shù)較高,并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),菌落總數(shù)呈上升趨勢(shì),貯藏至第12 d時(shí)菇體表面菌落總數(shù)達(dá)到1.44×105CFU/g,同時(shí)菇體發(fā)生嚴(yán)重褐變、發(fā)粘、異味現(xiàn)象,失去商品價(jià)值。

表1 貯藏時(shí)間對(duì)雙孢蘑菇表面細(xì)菌總數(shù)的影響Table 1 Effects of storage time on the total colony number of bacteria on ABFB

2.2 雙孢蘑菇表面菌相變化分析

2.2.1 雙孢蘑菇表面可培養(yǎng)細(xì)菌分析 采用傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)方法共分離到36個(gè)菌株。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖1,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶均明亮單一,大小約1800 bp,為目標(biāo)產(chǎn)物,可用于后續(xù)測(cè)序。

圖1 雙孢蘑菇可培養(yǎng)細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of culturable bacteria from ABFB

測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)和分析,其中鑒定出4個(gè)相同菌株,合并后為33個(gè)菌種,隸屬于4個(gè)門(mén),分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和細(xì)菌門(mén)(Bacteriophyta);屬于21個(gè)菌屬,分別是微小桿菌屬(Exiguobacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、乳球菌屬(Lactococcus)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、賴(lài)氏菌屬(Leifsonia)、微桿菌屬(Microbacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、壤霉菌屬(Agromyces)、束毛球菌屬(Trichococcus)、考克氏菌屬(Kocuria)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、Chryseomicrobium屬、動(dòng)性球菌屬(Planococcus)、西地西菌屬(Cedecea)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。

鑒定分離出棒桿狀菌株19個(gè),球狀菌株14個(gè);革蘭氏陽(yáng)性菌株有28個(gè),革蘭氏陰性?xún)H有5株,菌株編號(hào)為2、3、22、24和26號(hào)5個(gè)菌株鑒定出有芽孢,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 雙孢蘑菇貯藏過(guò)程中的可培養(yǎng)細(xì)菌的組成及生物學(xué)特性Table 2 Composition and biological characteristics of culturable bacteria from ABFB during storage

2.2.2 高通量測(cè)序分析 由表3和表4可以看出,測(cè)序有效數(shù)據(jù)率在92%以上,可用于后續(xù)分析。各組Chao1和Ace指數(shù)數(shù)值近似,表明各樣本中物種數(shù)均較為豐富,物種數(shù)由大到小為S3、S0、S2、S1,即細(xì)菌物種種類(lèi)最豐富的為貯藏保鮮12 d的雙孢蘑菇,物種種類(lèi)最稀少為貯藏4 d的雙孢蘑菇。文庫(kù)覆蓋度Goods coverage均大于0.978,顯示測(cè)序?qū)颖局屑?xì)菌的覆蓋率很高，測(cè)序深度適合，注釋結(jié)果可以反映樣品中細(xì)菌豐富度的真實(shí)情況。根據(jù)各組樣品Chao1和Ace指數(shù),4 ℃低溫下保鮮的雙孢蘑菇隨貯藏時(shí)間增加菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化,細(xì)菌群落豐度有所增加。

表3 雙孢蘑菇中細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of high-throughput sequencing of bacteria from ABFB

表4 雙孢蘑菇中細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果的α多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity indices of high throughput sequencing results of bacteria from ABFB

Alpha多樣性分析蘑菇表面細(xì)菌豐度和多樣性,圖2為4個(gè)樣品的Shannon稀疏曲線(xiàn)與主成分分析(PCA)圖,可分別表示樣品測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和不同樣品間可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況,其中PCA分析圖通過(guò)分析不同樣品的OTU(97%相似性)組成,運(yùn)用方差分解,將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上,樣本組成越相似,其反映在PCA圖中的距離越近。

圖2(A)圖中可以看出,4個(gè)不同貯藏保鮮時(shí)間的雙孢蘑菇樣品的Shannon稀疏曲線(xiàn)趨于平坦,表明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大,可反映樣本中絕大多數(shù)微生物信息,隨測(cè)序量增加，新的菌系不會(huì)被發(fā)現(xiàn),微生物多樣性也不會(huì)發(fā)生變化。圖2(B)表明:PCA1和PCA2分別在樣品差異性貢獻(xiàn)率上達(dá)到72%和19%,合計(jì)達(dá)到91%,是差異的主要來(lái)源。圖2(B)圖中樣品S0和S1距離最近,均位于PCA1和PCA2的負(fù)值區(qū)域,說(shuō)明二者細(xì)菌群落的相似度較高;S2與S0和S1相近性次之,同樣位于兩坐標(biāo)軸的負(fù)值區(qū)域,說(shuō)明三個(gè)樣品之間的主成分變異不顯著;樣品S3與其他樣品的距離較遠(yuǎn),細(xì)菌群落組相似度相對(duì)較低。所以,在4 ℃條件下,不同保鮮貯藏時(shí)間的雙孢蘑菇細(xì)菌群落分布發(fā)生顯著變化。

圖2 雙孢蘑菇細(xì)菌高通量測(cè)序Shannon-Wiener曲線(xiàn)和主成分分析圖Fig.2 Shannon-Wiener curve and principal component analysis for high throughput sequencing of bacteria from ABFB

圖3可直觀(guān)展現(xiàn)雙孢蘑菇樣品表面細(xì)菌群落基因測(cè)序的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。4個(gè)不同貯藏保鮮時(shí)間的雙孢蘑菇樣品測(cè)序共獲得OTU為17666個(gè),S0、S1、S2和S3四個(gè)樣品特有的OUT序列數(shù)分別為3790、3112、4912和3338。S0與S1重疊的OTU序列數(shù)最多為1469個(gè),顯示這兩個(gè)樣品之間的菌群相似度最高。

圖3 不同貯藏時(shí)間的雙孢蘑菇細(xì)菌高通量測(cè)序韋恩圖Fig.3 Venn diagram of high-throughput sequencing of bacteria from ABFB at different storage time

2.3 貯藏期間雙孢蘑菇表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 雙孢蘑菇基于門(mén)水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 圖4是基于門(mén)繪制的微生物群落結(jié)構(gòu)變化圖,對(duì)各樣品中的OTU依次進(jìn)行門(mén)、綱、目、科、屬的分類(lèi)信息分析,一共獲得30個(gè)門(mén)的細(xì)菌。其中Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Firmicutes的微生物種類(lèi)占比最高。

圖5 雙孢蘑菇基于屬水平的細(xì)菌分析圖Fig.5 Frequencies of different genus bacteria from ABFB

隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),基于門(mén)的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。雙孢蘑菇在4 ℃貯藏保鮮期間Proteobacteria豐度顯著增加,在新鮮采摘的雙孢蘑菇中Proteobacteria豐度為50.02%,貯藏4 d時(shí)上升為58.09%,到第12 d時(shí)達(dá)到64.33%,成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌;Verrucomicrobia和Actinobacteria豐度變化小;Bacteroidetes豐度逐漸下降,從11.18%(0 d)下降至7.74%(4 d),進(jìn)一步降至6.81%(14 d)。Planctomycetes和Firmicutes所有樣品中所占比例較小且變化規(guī)律相同,均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降。Planctomycetes豐度值為11.18%,至樣品貯藏終點(diǎn)時(shí)減少至6.81%;Firmicutes豐度值則從7.29%下降至1.48%。由此可知,雙孢蘑菇在4 ℃條件下低溫貯藏保鮮可以抑制Bacteroidetes和Firmicutes生長(zhǎng),但對(duì)Planctomycetes和Actinobacteria的抑制作用不明顯。

2.3.2 雙孢蘑菇基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 除去無(wú)法歸類(lèi)和其他的菌屬,共檢測(cè)到48個(gè)屬的細(xì)菌,其中Pseudomonas、德沃斯氏菌屬Devosia、Arthrobacter、布丘氏菌屬Buttiauxella、Rhizobium為占比例前5的屬。采摘的雙孢蘑菇(S0)中檢測(cè)到19個(gè)屬的細(xì)菌,其中Devosia為主要微生物,占到8.79%,貯藏保鮮12 d時(shí)下降到4.59%;Pseudomonas則從保鮮第4 d的1.26%,在貯藏第12 d時(shí)上升到24.48%,成為優(yōu)勢(shì)菌屬。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)利用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法,從4 ℃保鮮貯藏條件下的雙孢蘑菇中共分離純化出4個(gè)門(mén)21個(gè)屬中的33種細(xì)菌,而采用16S rRNA高通量測(cè)序共獲得30個(gè)門(mén)48個(gè)菌屬的細(xì)菌?？吕蚰鹊萚14]從腐爛的雙孢蘑菇中分離鑒定到6株細(xì)菌,分別為2株黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacterguillouiae)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)和阿氏腸桿菌(Enterobacterasouriae)。上述報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)的研究結(jié)果有所些不同,可能與雙孢蘑菇的產(chǎn)地、種植環(huán)境、流通環(huán)節(jié)等差異有關(guān)。王瓊英等[15]以金針菇、杏鮑菇、蟹味菇鮮品為材料,采用高通量測(cè)序的方法分析貨架期內(nèi)其外源細(xì)菌數(shù)量及群落多樣性的變化。結(jié)果表明:金針菇貨架期外源細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度最高的屬分別為乳球菌屬,杏鮑菇和蟹味菇的優(yōu)勢(shì)菌屬則是假單胞菌屬,三種食用菌在貨架期內(nèi)外源細(xì)菌數(shù)量明顯增加,外源細(xì)菌種類(lèi)及相對(duì)豐度在貨架期呈動(dòng)態(tài)變化,說(shuō)明不同食用菌在貯藏過(guò)程中,主要的優(yōu)勢(shì)菌不同。而Leff等[16]利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)包括雙孢蘑菇在內(nèi)的11種果蔬進(jìn)行表面的菌相變化研究,結(jié)果表明:雙孢蘑菇表面假單胞菌OTU數(shù)量最多,占比約11.3%,說(shuō)明假單胞菌是雙孢蘑菇的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。Tarlak等[17]研究溫度對(duì)雙孢蘑菇切片中假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響,發(fā)現(xiàn)蘑菇切片的L值與假單胞菌的數(shù)量有關(guān),當(dāng)假單胞菌的數(shù)量達(dá)到109CFU/g時(shí),L值約為80,雙孢蘑菇切片失去商品價(jià)值,這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致,均表明假單胞菌是雙孢蘑菇貯藏保鮮過(guò)程中的主要優(yōu)勢(shì)菌和致腐菌。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)微生物平板培養(yǎng)方法,從4 ℃保鮮貯藏下的雙孢蘑菇中共分離純化出4個(gè)門(mén)21個(gè)屬的33個(gè)種的細(xì)菌,結(jié)果表明:新鮮采收的雙孢蘑菇表面菌落總數(shù)較高,并且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì);而采用高通量測(cè)序分析共獲得30個(gè)門(mén)48個(gè)屬的細(xì)菌,根據(jù)Shannon、Chao1、Ace指數(shù)和Alpha多樣性分析,結(jié)果表明:4 ℃低溫下保鮮的雙孢蘑菇隨貯藏時(shí)間增加菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化,細(xì)菌群落豐度有所增加,不同保鮮貯藏時(shí)間的雙孢蘑菇細(xì)菌群落分布顯著變化;Exiguobacterium、Rhizobium、Arthrobacter、Trichococcus、Staphylococcus和Pseudomonas6個(gè)屬細(xì)菌在上述兩種方法中均被分離檢測(cè)出來(lái),且Pseudomonasspp.為雙孢蘑菇貯藏保鮮過(guò)程中的主要致腐菌。盡管高通量測(cè)序方法應(yīng)用于食品中存在的微生物分類(lèi)和鑒定會(huì)更加全面準(zhǔn)確,但是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法也分離鑒定出了一些高通量測(cè)序未能檢測(cè)出的特有的菌屬,如解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、乳酸鏈球菌(Lactococcuslactissubsp.)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.)。本文將上述兩種方法相結(jié)合,對(duì)雙孢蘑菇表面細(xì)菌的群落組成、相對(duì)豐富度以及多樣性進(jìn)行了分析,可以更加全面地掌握雙孢蘑菇在貯藏保鮮過(guò)程中的微生物種類(lèi)和變化動(dòng)態(tài),為延長(zhǎng)雙孢蘑菇的貯藏保鮮期以及雙孢蘑菇的腐敗變制質(zhì)機(jī)理的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。