樺褐孔菌多糖的乙?；揎椉捌淇寡趸钚?/h1>
2019-06-24 08:48:00邵珠領(lǐng)吳艷麗王宇亮趙芷萌
食品工業(yè)科技 2019年9期
邵珠領(lǐng),吳艷麗,張 宇,*,王宇亮,趙 宏,趙芷萌
(1.黑龍江省新藥創(chuàng)制與藥效毒理評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007; 2.生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心,哈爾濱商業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150070)
樺褐孔菌Inonotusobliquus(Fr.)Pilat屬擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱銹革孔菌目銹革菌科褐臥孔菌屬[1]。樺褐孔菌主要分布在北半球北緯 40～50°的地區(qū),如北美(北部)、芬蘭、波蘭、俄羅斯(西西伯利亞、遠(yuǎn)東部分地區(qū)、堪察加半島)、日本北海道等國(guó)家和地區(qū)[2]。我國(guó)樺褐孔菌主要分布在吉林長(zhǎng)白山地區(qū)、黑龍江大小興安嶺以及內(nèi)蒙古等地[3]。樺褐孔菌具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗寄生蟲(chóng)等多種藥理活性,而其大部分生物活性與其中的多糖成分密切相關(guān)[4]。
多糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾主要是利用多糖分子中的羥基、羧基、氨基等活性基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)以引入新的基團(tuán),如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等[5]。多糖的乙?；且环N重要的多糖修飾方法。乙酰基的引入使分子的伸展?fàn)顟B(tài)發(fā)生變化,導(dǎo)致多糖極性基團(tuán)暴露,增加了多糖在水中的溶解性,同時(shí)乙?；臄?shù)量和位置對(duì)多糖活性也有顯著影響[6]。真菌多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),經(jīng)化學(xué)修飾后,可能會(huì)提高多糖抗氧化、降血糖等作用[7-8]。楊春瑜等研究發(fā)現(xiàn),對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行乙?；揎椇?其抗氧化活性增加[9]。李淑琴等研究表明,乙?；癁觚埐瓒嗵侨芙庑栽鰪?qiáng),還原活性顯著提高[10]。目前的文獻(xiàn)對(duì)研究樺褐孔菌多糖的研究主要集中在提取分離等方面[11-12],關(guān)于其乙酰化修飾及其修飾后活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
因此,本文以乙酸酐作為酰化試劑，對(duì)提取純化后的樺褐孔菌多糖進(jìn)行乙酰化修飾，并評(píng)價(jià)其抗氧化活性,為樺褐孔菌多糖抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
樺褐孔菌 購(gòu)自黑龍江省佳木斯市亮子河山特產(chǎn)店；苯酚、氫氧化鈉、濃鹽酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、無(wú)水乙酸鈉、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、乙酸酐、無(wú)水乙醇 均為國(guó)產(chǎn)分析純;葡萄糖、氯化乙酰膽堿 購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋Mw3000 購(gòu)自源葉生物科技有限公司。
FDU-1200冷凍干燥機(jī) 日本東京理化;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DL-5-B 低速多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DBS100 自動(dòng)餾分收集器 上海嘉鵬科技有限公司;Vortex-1/2 渦旋混合器 上海滬西分析儀器廠有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樺褐孔菌多糖的提取 樺褐孔菌菌體粉碎后過(guò)80目篩,25 ℃條件下用95%乙醇浸泡1 d,減壓過(guò)濾,濾餅(半徑:7 cm,高:3 cm)50 ℃烘干24 h后備用。
取一定量烘干后的樺褐孔菌濾餅加入5倍體積的雙蒸水95 ℃浸提3 h[11],過(guò)八層紗布保留濾液,濾渣重復(fù)提取一次,合并濾液,減壓濃縮。濃縮液加入一定量的乙醇,使乙醇濃度達(dá)到80%,充分?jǐn)嚢韬蠓湃? ℃冰箱中醇沉12 h。25 ℃,4000 r/min離心10 min,收集沉淀,依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌沉淀3次,130 Pa 45 ℃真空干燥12 h后得到樺褐孔菌粗多糖。按照以下公式來(lái)計(jì)算樺褐孔菌多糖的得率。
1.2.2 樺褐孔菌多糖的純化 取真空干燥后的樺褐孔菌粗多糖適量,使用雙蒸水配制成10%多糖溶液,按體積比1∶4加入Sevag試劑,充分振蕩30 min后靜置4 h。4000 r/min 25 ℃離心15 min,棄去下層蛋白,重復(fù)上述操作,紫外掃描檢測(cè),直至樺褐孔菌多糖溶液在260和280 nm波長(zhǎng)處無(wú)明顯紫外吸收,表示溶液中游離蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)已除盡。將脫蛋白后的多糖溶液55 ℃條件下減壓濃縮至原溶液1/3后冷凍干燥,得到樺褐孔菌粗多糖。
取5 g脫蛋白的樺褐孔菌粗多糖溶于10 mL雙蒸水中,4000 r/min 25 ℃離心15 min后,取上清液在已準(zhǔn)備好的AB-8大孔樹(shù)脂柱上進(jìn)行上樣。吸附24 h后用雙蒸水進(jìn)行洗脫,自動(dòng)餾分收集器收集洗脫液,采用苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)(紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))隔管檢測(cè)吸光度,合并洗脫液。洗脫液55 ℃條件下減壓濃縮至原溶液1/3后透析(44 mm),冷凍干燥得到純化后的樺褐孔菌純化多糖。純化后的樺褐孔菌多糖以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸法測(cè)定其總糖含量。
1.2.3 樺褐孔菌多糖的乙酰化修飾 取0.5 g樺褐孔菌純化多糖溶于10 mL三蒸水中,用3%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至11.0。30 ℃油浴下,分別交替加入氫氧化鈉溶液和乙酸酐各1 mL,控制反應(yīng)溶液pH在7.0～11.0,直至加完乙酸酐。30 ℃條件下維持?jǐn)嚢? h(pH=8)。反應(yīng)結(jié)束后,用1 mol/L鹽酸中和反應(yīng)溶液(pH=7),將反應(yīng)液置于自來(lái)水中透析48 h,三蒸水中透析24 h。將透析液減壓濃縮,冷凍干燥后得到乙?；瘶搴挚拙嗵荹13]。另取兩份相同量的樺褐孔菌純化多糖,加入乙酸酐的量分別為2、3 mL,其余實(shí)驗(yàn)條件不變。
1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 取純化樺褐孔菌多糖與加入1 mL乙酸酐乙?；蟮玫降臉搴挚拙嗵歉? mg,采用溴化鉀壓片法,使用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。
1.2.5 乙?；〈鹊臏y(cè)定
1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用0.001 mol/L醋酸鈉溶液將氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為1.064 mg/mL的溶液。精密移取氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于試管中,加水至1 mL,加入2 mL堿性羥胺溶液,渦旋混合器混合均勻,于25 ℃放置4 min,加入1 mL 4 mol/L鹽酸(pH為1.2±0.2),加入1 mL 0.37 mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液,搖勻后在540 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。同步做上述各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的空白對(duì)照,先加入鹽酸后加入堿性羥胺,其余步驟與上述相同。
1.2.5.2 取代度測(cè)定 取樺褐孔菌多糖乙?；芤? mL按照標(biāo)準(zhǔn)溶液的操作方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到乙酰化樺褐孔菌多糖的乙?；|(zhì)量M1,按照以下公式計(jì)算出三個(gè)不同取代度的乙酰化樺褐孔菌多糖的取代度[14]。
乙酰基百分含量(W,%)=M1/M2×100
式中：M1-乙?；瘶搴挚拙嗵侵幸阴；馁|(zhì)量(mg);M2-乙?；瘶搴挚拙嗵堑馁|(zhì)量(mg);162-葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量;43-乙?；鄬?duì)分子質(zhì)量;1-氫原子相對(duì)原子質(zhì)量。
1.2.6 體外抗氧化活性研究
1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取3種不同取代度,不同濃度的樺褐孔菌乙?；嗵羌凹兓髽搴挚拙嗵菢悠啡芤? mL,加入新鮮配制的DPPH-乙醇溶液1 mL,渦旋混合器混合10秒,25 ℃水浴避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光度;以VC為陽(yáng)性對(duì)照,同時(shí)測(cè)定空白組(樣品不加DPPH)和陽(yáng)性對(duì)照組樣品吸光度。按如下公式計(jì)算對(duì)DPPH自由基清除率。
DPPH·清除率(%)=1-(A1-A2)/A0)×100
式中:A0-無(wú)樣品溶液吸光度值；A1-樣品溶液的吸光度值;A2-無(wú)DPPH樣品溶液的吸光度值。
式中:A0-Tris-HCI溶液吸光值;A1-不加樣品的Tris-HCI和鄰苯三酚溶液的吸光度;A2-樣品溶液的吸光度。
1.2.6.3 羥基自由基清除率的測(cè)定 在試管中依次加入不同濃度、不同取代度的三種乙?；瘶搴挚拙嗵羌皹搴挚拙嗵菢悠啡芤? mL、0.75 mmol/L鄰菲羅啉溶液1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL、0.01%雙氧水1 mL、0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)1.5 mL混勻,室溫靜置10 min,37 ℃加熱1 h,在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。蒸餾水和VC分別作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,按以下公式來(lái)計(jì)算羥自由基(·OH)的清除率(%)。
·OH清除率(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100
式中:A0-空白組樣品溶液吸光值;A1-樣品溶液吸光度值;A2-對(duì)照品溶液的吸光度(雙氧水和樣品溶液用蒸餾水來(lái)代替)。
1.3 數(shù)據(jù)分析
以上實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次,所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0 處理,使用Duncan’s檢驗(yàn)分析顯著性,p<0.05表示差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 樺褐孔菌多糖的制備及純化
脫蛋白后的樺褐孔菌多糖使用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液,紫外掃描后結(jié)果如圖1所示,在260和280 nm處無(wú)明顯紫外吸收,表明脫蛋白后的樺褐孔菌多糖已基本除去蛋白類(lèi)雜質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定脫蛋白后的樺褐孔菌多糖的蛋白含量為3.24%±1.23%。因?yàn)橐呀?jīng)使用Sevag法除去蛋白類(lèi)物質(zhì),檢測(cè)到的可能是與多糖結(jié)合的蛋白類(lèi)雜質(zhì)。醇沉后的樺褐孔菌多糖,經(jīng)真空冷凍干燥后,計(jì)算樺褐孔菌粗多糖提取率為13.2%。經(jīng)AB-8純化的洗脫曲線(xiàn)(圖2),收集Fr.1部分,減壓濃縮、冷凍干燥后得樺褐孔菌純化多糖。
圖1 樺褐孔菌多糖純化處理后紫外掃描圖譜Fig.1 The ultraviolet spectra of Inonotus obliquuspolysaccharides solution after purification
圖2 樺褐孔菌多糖經(jīng)AB-8純化洗脫曲線(xiàn)Fig.2 Purification and elution curve of Inonotus obliquus polysaccharides by AB-8
2.2 樺褐孔菌多糖與乙?；瘶搴挚拙嗵堑募t外光譜分析結(jié)果
如圖3所示,與樺褐孔菌多糖的IR圖譜相比,乙?；瘶搴挚拙嗵窃?713.66 cm-1波長(zhǎng)處出現(xiàn)C=O雙鍵伸縮振動(dòng)峰,1230.41 cm-1波長(zhǎng)處有酯基的C-O的伸縮振動(dòng),這表明樣品的乙酰化是成功的[15]。乙酰化多糖在3400.00 cm-1左右的-OH吸收有所減弱,推測(cè)可能是因?yàn)椴糠痔擎溤谛揎椀倪^(guò)程中被水解。
圖3 樺褐孔菌多糖(A)與乙?；瘶搴挚拙嗵?B)的紅外譜圖Fig.3 IR spectrum of Inonotus obliquus polysaccharides and acetylated Inonotus obolquus polysaccharides
2.3 乙酰化樺褐孔菌多糖取代度測(cè)定結(jié)果
氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品乙?；鶟舛扰c其吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。樺褐孔菌乙?；揎椀囊阴；颗c取代度如表1所示,純化后樺褐孔菌多糖中總糖含量為82.1%,不含乙酰基,經(jīng)乙?；揎椇?隨著乙酰化試劑體積的增加,總糖含量減少,乙?；吭黾?取代度也逐步提高。加入乙酸酐體積1、2、3 mL時(shí),乙?；糠謩e為15.43、17.22、22.36 μg/mL;取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072。
圖4 氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 The standard curve of acetylcholine chloride
表1 樺褐孔菌多糖乙酰化修飾的乙?；颗c取代度Table 1 Acetyl content and substitution degree of acetylated modification of Inonotus obliquus polysaccharides
2.4 乙?；揎棇?duì)樺褐孔菌多糖體外抗氧化活性的影響
2.4.1 DPPH自由基清除率變化 如圖5所示,修飾后的樺褐孔菌多糖DPPH自由基清除率均隨多糖質(zhì)量濃度增加而增加,并且呈一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,可以觀察到樺褐孔菌多糖和乙?；瘶搴挚拙嗵堑那宄孰S著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。并且在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),3種乙?；潭炔煌臉搴挚拙嗵荄PPH清除率分別為71.5%、74.3%、75.4%,取代度越大,清除作用越強(qiáng),顯著高于樺褐孔菌多糖的清除率60.1%(p<0.05)。說(shuō)明乙酰化修飾可以增強(qiáng)樺褐孔菌多糖清除DPPH自由基的能力。
圖5 乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 DPPH radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP注:VC:維生素C;IOP:樺褐孔菌多糖;Ac1-IOP:乙酰化樺褐孔菌多糖1;Ac2-IOP:乙?；瘶搴挚拙嗵?;Ac3-IOP:乙?；瘶搴挚拙嗵?；乙?；瘶搴挚拙嗵?～3的取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072；圖6～圖7同。
2.4.2 超氧陰離子清除率變化 由圖6可知,在所選的濃度范圍內(nèi),樺褐孔菌多糖與乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)超氧陰離子的清除作用均隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。不同取代度的乙?；瘶搴挚拙嗵窃谫|(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),分別達(dá)到的最大清除率為71.8%、74.9%、78.5%。隨著取代度的增加,清除作用也隨之增強(qiáng)。而樺褐孔菌多糖的最大清除率為61.8%。這表明,對(duì)樺褐孔菌多糖進(jìn)行乙?；揎椖茱@著提高其對(duì)超氧陰離子的清除作用(p<0.05)。
圖6 乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)超氧陰離子自由基的清除作用 radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP
2.4.3 羥基自由基清除率變化 圖7結(jié)果表明,在0.5～5 mg/mL濃度范圍內(nèi),隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,樺褐孔菌多糖與乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)羥基自由基的清除作用增強(qiáng),樺褐孔菌多糖與不同取代度的乙?；瘶搴挚拙嗵堑淖畲笄宄史謩e為61.5%和74.5%、79.9%、81.1%。說(shuō)明羥基自由基清除率隨著取代度的增加而增強(qiáng)。這表明對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行乙?；揎椖軌蝻@著提高其羥基自由基清除能力(p<0.05)。
圖7 乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)羥基自由基的清除作用Fig.7 ·OH- radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP
乙?；揎検浅Ｓ玫囊环N分子修飾方法,結(jié)構(gòu)修飾逐漸成為多糖構(gòu)效關(guān)系的研究熱點(diǎn),乙酰化修飾可以改變多糖分子的定向性和橫向次序,從而改變糖鏈的空間排布,改善其活性[16-17]。大量研究表明,乙?；揎椏梢栽鰪?qiáng)多糖的抗凝血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化活性[18-19]。許多多糖在體外本身具有一定的抗氧化活性,經(jīng)乙酰化修飾后的多糖其清除自由基的能力均有所增加,且還原能力也比原多糖有所提高[20]。實(shí)驗(yàn)表明,隨著乙酰化程度的提高,乙?；瘶搴挚拙嗵堑目寡趸钚跃兴鰪?qiáng)。Yang等人對(duì)龍眼果實(shí)的果皮中的多糖進(jìn)行乙?；揎椦芯?發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性與乙酰基取代度有關(guān)[21]。這與本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。乙?；瘶搴挚拙嗵堑目寡趸钚栽鰪?qiáng),可能是由于引入乙酰基后,使多糖支鏈得到伸展,導(dǎo)致多糖羥基暴露,向外伸展,從而有利于捕捉自由基，提高其抗氧化活性[22]。
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)在氫氧化鈉的均相體系中,以不同體積的乙酸酐為?；噭?duì)樺褐孔菌進(jìn)行乙酰化修飾,調(diào)整反應(yīng)液的pH在一定的范圍內(nèi),獲得3個(gè)取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072的乙?；瘶搴挚拙嗵?。進(jìn)一步進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)乙?；揎椇蟮臉搴挚拙嗵菍?duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除率相對(duì)樺褐孔菌多糖都有一定的提高。乙?；瘶搴挚拙嗵堑目寡趸钚耘c乙酰基取代度有關(guān)。本研究為樺褐孔菌多糖構(gòu)效關(guān)系研究提供了新的研究方向,為樺褐孔菌的化學(xué)修飾提供了重要的參考。
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多糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾主要是利用多糖分子中的羥基、羧基、氨基等活性基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)以引入新的基團(tuán),如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等[5]。多糖的乙?；且环N重要的多糖修飾方法。乙酰基的引入使分子的伸展?fàn)顟B(tài)發(fā)生變化,導(dǎo)致多糖極性基團(tuán)暴露,增加了多糖在水中的溶解性,同時(shí)乙?；臄?shù)量和位置對(duì)多糖活性也有顯著影響[6]。真菌多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),經(jīng)化學(xué)修飾后,可能會(huì)提高多糖抗氧化、降血糖等作用[7-8]。楊春瑜等研究發(fā)現(xiàn),對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行乙?；揎椇?其抗氧化活性增加[9]。李淑琴等研究表明,乙?；癁觚埐瓒嗵侨芙庑栽鰪?qiáng),還原活性顯著提高[10]。目前的文獻(xiàn)對(duì)研究樺褐孔菌多糖的研究主要集中在提取分離等方面[11-12],關(guān)于其乙酰化修飾及其修飾后活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
因此,本文以乙酸酐作為酰化試劑，對(duì)提取純化后的樺褐孔菌多糖進(jìn)行乙酰化修飾，并評(píng)價(jià)其抗氧化活性,為樺褐孔菌多糖抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
樺褐孔菌 購(gòu)自黑龍江省佳木斯市亮子河山特產(chǎn)店；苯酚、氫氧化鈉、濃鹽酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、無(wú)水乙酸鈉、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、乙酸酐、無(wú)水乙醇 均為國(guó)產(chǎn)分析純;葡萄糖、氯化乙酰膽堿 購(gòu)自阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋Mw3000 購(gòu)自源葉生物科技有限公司。
FDU-1200冷凍干燥機(jī) 日本東京理化;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DL-5-B 低速多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DBS100 自動(dòng)餾分收集器 上海嘉鵬科技有限公司;Vortex-1/2 渦旋混合器 上海滬西分析儀器廠有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 樺褐孔菌多糖的提取 樺褐孔菌菌體粉碎后過(guò)80目篩,25 ℃條件下用95%乙醇浸泡1 d,減壓過(guò)濾,濾餅(半徑:7 cm,高:3 cm)50 ℃烘干24 h后備用。
取一定量烘干后的樺褐孔菌濾餅加入5倍體積的雙蒸水95 ℃浸提3 h[11],過(guò)八層紗布保留濾液,濾渣重復(fù)提取一次,合并濾液,減壓濃縮。濃縮液加入一定量的乙醇,使乙醇濃度達(dá)到80%,充分?jǐn)嚢韬蠓湃? ℃冰箱中醇沉12 h。25 ℃,4000 r/min離心10 min,收集沉淀,依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌沉淀3次,130 Pa 45 ℃真空干燥12 h后得到樺褐孔菌粗多糖。按照以下公式來(lái)計(jì)算樺褐孔菌多糖的得率。
1.2.2 樺褐孔菌多糖的純化 取真空干燥后的樺褐孔菌粗多糖適量,使用雙蒸水配制成10%多糖溶液,按體積比1∶4加入Sevag試劑,充分振蕩30 min后靜置4 h。4000 r/min 25 ℃離心15 min,棄去下層蛋白,重復(fù)上述操作,紫外掃描檢測(cè),直至樺褐孔菌多糖溶液在260和280 nm波長(zhǎng)處無(wú)明顯紫外吸收,表示溶液中游離蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)已除盡。將脫蛋白后的多糖溶液55 ℃條件下減壓濃縮至原溶液1/3后冷凍干燥,得到樺褐孔菌粗多糖。
取5 g脫蛋白的樺褐孔菌粗多糖溶于10 mL雙蒸水中,4000 r/min 25 ℃離心15 min后,取上清液在已準(zhǔn)備好的AB-8大孔樹(shù)脂柱上進(jìn)行上樣。吸附24 h后用雙蒸水進(jìn)行洗脫,自動(dòng)餾分收集器收集洗脫液,采用苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)(紫外可見(jiàn)分光光度計(jì))隔管檢測(cè)吸光度,合并洗脫液。洗脫液55 ℃條件下減壓濃縮至原溶液1/3后透析(44 mm),冷凍干燥得到純化后的樺褐孔菌純化多糖。純化后的樺褐孔菌多糖以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸法測(cè)定其總糖含量。
1.2.3 樺褐孔菌多糖的乙酰化修飾 取0.5 g樺褐孔菌純化多糖溶于10 mL三蒸水中,用3%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH至11.0。30 ℃油浴下,分別交替加入氫氧化鈉溶液和乙酸酐各1 mL,控制反應(yīng)溶液pH在7.0～11.0,直至加完乙酸酐。30 ℃條件下維持?jǐn)嚢? h(pH=8)。反應(yīng)結(jié)束后,用1 mol/L鹽酸中和反應(yīng)溶液(pH=7),將反應(yīng)液置于自來(lái)水中透析48 h,三蒸水中透析24 h。將透析液減壓濃縮,冷凍干燥后得到乙?；瘶搴挚拙嗵荹13]。另取兩份相同量的樺褐孔菌純化多糖,加入乙酸酐的量分別為2、3 mL,其余實(shí)驗(yàn)條件不變。
1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 取純化樺褐孔菌多糖與加入1 mL乙酸酐乙?；蟮玫降臉搴挚拙嗵歉? mg,采用溴化鉀壓片法,使用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。
1.2.5 乙?；〈鹊臏y(cè)定
1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用0.001 mol/L醋酸鈉溶液將氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為1.064 mg/mL的溶液。精密移取氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于試管中,加水至1 mL,加入2 mL堿性羥胺溶液,渦旋混合器混合均勻,于25 ℃放置4 min,加入1 mL 4 mol/L鹽酸(pH為1.2±0.2),加入1 mL 0.37 mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液,搖勻后在540 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度。同步做上述各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的空白對(duì)照,先加入鹽酸后加入堿性羥胺,其余步驟與上述相同。
1.2.5.2 取代度測(cè)定 取樺褐孔菌多糖乙?；芤? mL按照標(biāo)準(zhǔn)溶液的操作方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到乙酰化樺褐孔菌多糖的乙?；|(zhì)量M1,按照以下公式計(jì)算出三個(gè)不同取代度的乙酰化樺褐孔菌多糖的取代度[14]。
乙酰基百分含量(W,%)=M1/M2×100
式中：M1-乙?；瘶搴挚拙嗵侵幸阴；馁|(zhì)量(mg);M2-乙?；瘶搴挚拙嗵堑馁|(zhì)量(mg);162-葡萄糖相對(duì)分子質(zhì)量;43-乙?；鄬?duì)分子質(zhì)量;1-氫原子相對(duì)原子質(zhì)量。
1.2.6 體外抗氧化活性研究
1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 取3種不同取代度,不同濃度的樺褐孔菌乙?；嗵羌凹兓髽搴挚拙嗵菢悠啡芤? mL,加入新鮮配制的DPPH-乙醇溶液1 mL,渦旋混合器混合10秒,25 ℃水浴避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光度;以VC為陽(yáng)性對(duì)照,同時(shí)測(cè)定空白組(樣品不加DPPH)和陽(yáng)性對(duì)照組樣品吸光度。按如下公式計(jì)算對(duì)DPPH自由基清除率。
DPPH·清除率(%)=1-(A1-A2)/A0)×100
式中:A0-無(wú)樣品溶液吸光度值；A1-樣品溶液的吸光度值;A2-無(wú)DPPH樣品溶液的吸光度值。
式中:A0-Tris-HCI溶液吸光值;A1-不加樣品的Tris-HCI和鄰苯三酚溶液的吸光度;A2-樣品溶液的吸光度。
1.2.6.3 羥基自由基清除率的測(cè)定 在試管中依次加入不同濃度、不同取代度的三種乙?；瘶搴挚拙嗵羌皹搴挚拙嗵菢悠啡芤? mL、0.75 mmol/L鄰菲羅啉溶液1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL、0.01%雙氧水1 mL、0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)1.5 mL混勻,室溫靜置10 min,37 ℃加熱1 h,在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。蒸餾水和VC分別作為空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,按以下公式來(lái)計(jì)算羥自由基(·OH)的清除率(%)。
·OH清除率(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100
式中:A0-空白組樣品溶液吸光值;A1-樣品溶液吸光度值;A2-對(duì)照品溶液的吸光度(雙氧水和樣品溶液用蒸餾水來(lái)代替)。
1.3 數(shù)據(jù)分析
以上實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次,所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0 處理,使用Duncan’s檢驗(yàn)分析顯著性,p<0.05表示差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 樺褐孔菌多糖的制備及純化
脫蛋白后的樺褐孔菌多糖使用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液,紫外掃描后結(jié)果如圖1所示,在260和280 nm處無(wú)明顯紫外吸收,表明脫蛋白后的樺褐孔菌多糖已基本除去蛋白類(lèi)雜質(zhì)。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定脫蛋白后的樺褐孔菌多糖的蛋白含量為3.24%±1.23%。因?yàn)橐呀?jīng)使用Sevag法除去蛋白類(lèi)物質(zhì),檢測(cè)到的可能是與多糖結(jié)合的蛋白類(lèi)雜質(zhì)。醇沉后的樺褐孔菌多糖,經(jīng)真空冷凍干燥后,計(jì)算樺褐孔菌粗多糖提取率為13.2%。經(jīng)AB-8純化的洗脫曲線(xiàn)(圖2),收集Fr.1部分,減壓濃縮、冷凍干燥后得樺褐孔菌純化多糖。
圖1 樺褐孔菌多糖純化處理后紫外掃描圖譜Fig.1 The ultraviolet spectra of Inonotus obliquuspolysaccharides solution after purification
圖2 樺褐孔菌多糖經(jīng)AB-8純化洗脫曲線(xiàn)Fig.2 Purification and elution curve of Inonotus obliquus polysaccharides by AB-8
2.2 樺褐孔菌多糖與乙?；瘶搴挚拙嗵堑募t外光譜分析結(jié)果
如圖3所示,與樺褐孔菌多糖的IR圖譜相比,乙?；瘶搴挚拙嗵窃?713.66 cm-1波長(zhǎng)處出現(xiàn)C=O雙鍵伸縮振動(dòng)峰,1230.41 cm-1波長(zhǎng)處有酯基的C-O的伸縮振動(dòng),這表明樣品的乙酰化是成功的[15]。乙酰化多糖在3400.00 cm-1左右的-OH吸收有所減弱,推測(cè)可能是因?yàn)椴糠痔擎溤谛揎椀倪^(guò)程中被水解。
圖3 樺褐孔菌多糖(A)與乙?；瘶搴挚拙嗵?B)的紅外譜圖Fig.3 IR spectrum of Inonotus obliquus polysaccharides and acetylated Inonotus obolquus polysaccharides
2.3 乙酰化樺褐孔菌多糖取代度測(cè)定結(jié)果
氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品乙?；鶟舛扰c其吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。樺褐孔菌乙?；揎椀囊阴；颗c取代度如表1所示,純化后樺褐孔菌多糖中總糖含量為82.1%,不含乙酰基,經(jīng)乙?；揎椇?隨著乙酰化試劑體積的增加,總糖含量減少,乙?；吭黾?取代度也逐步提高。加入乙酸酐體積1、2、3 mL時(shí),乙?；糠謩e為15.43、17.22、22.36 μg/mL;取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072。
圖4 氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 The standard curve of acetylcholine chloride
表1 樺褐孔菌多糖乙酰化修飾的乙?；颗c取代度Table 1 Acetyl content and substitution degree of acetylated modification of Inonotus obliquus polysaccharides
2.4 乙?；揎棇?duì)樺褐孔菌多糖體外抗氧化活性的影響
2.4.1 DPPH自由基清除率變化 如圖5所示,修飾后的樺褐孔菌多糖DPPH自由基清除率均隨多糖質(zhì)量濃度增加而增加,并且呈一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,可以觀察到樺褐孔菌多糖和乙?；瘶搴挚拙嗵堑那宄孰S著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。并且在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),3種乙?；潭炔煌臉搴挚拙嗵荄PPH清除率分別為71.5%、74.3%、75.4%,取代度越大,清除作用越強(qiáng),顯著高于樺褐孔菌多糖的清除率60.1%(p<0.05)。說(shuō)明乙酰化修飾可以增強(qiáng)樺褐孔菌多糖清除DPPH自由基的能力。
圖5 乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 DPPH radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP注:VC:維生素C;IOP:樺褐孔菌多糖;Ac1-IOP:乙酰化樺褐孔菌多糖1;Ac2-IOP:乙?；瘶搴挚拙嗵?;Ac3-IOP:乙?；瘶搴挚拙嗵?；乙?；瘶搴挚拙嗵?～3的取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072；圖6～圖7同。
2.4.2 超氧陰離子清除率變化 由圖6可知,在所選的濃度范圍內(nèi),樺褐孔菌多糖與乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)超氧陰離子的清除作用均隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。不同取代度的乙?；瘶搴挚拙嗵窃谫|(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),分別達(dá)到的最大清除率為71.8%、74.9%、78.5%。隨著取代度的增加,清除作用也隨之增強(qiáng)。而樺褐孔菌多糖的最大清除率為61.8%。這表明,對(duì)樺褐孔菌多糖進(jìn)行乙?；揎椖茱@著提高其對(duì)超氧陰離子的清除作用(p<0.05)。
圖6 乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)超氧陰離子自由基的清除作用 radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP
2.4.3 羥基自由基清除率變化 圖7結(jié)果表明,在0.5～5 mg/mL濃度范圍內(nèi),隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,樺褐孔菌多糖與乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)羥基自由基的清除作用增強(qiáng),樺褐孔菌多糖與不同取代度的乙?；瘶搴挚拙嗵堑淖畲笄宄史謩e為61.5%和74.5%、79.9%、81.1%。說(shuō)明羥基自由基清除率隨著取代度的增加而增強(qiáng)。這表明對(duì)樺褐孔菌進(jìn)行乙?；揎椖軌蝻@著提高其羥基自由基清除能力(p<0.05)。
圖7 乙?；瘶搴挚拙嗵菍?duì)羥基自由基的清除作用Fig.7 ·OH- radical scavenging activities of acetylated polysaccharide Ac-IOP
乙?；揎検浅Ｓ玫囊环N分子修飾方法,結(jié)構(gòu)修飾逐漸成為多糖構(gòu)效關(guān)系的研究熱點(diǎn),乙酰化修飾可以改變多糖分子的定向性和橫向次序,從而改變糖鏈的空間排布,改善其活性[16-17]。大量研究表明,乙?；揎椏梢栽鰪?qiáng)多糖的抗凝血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化活性[18-19]。許多多糖在體外本身具有一定的抗氧化活性,經(jīng)乙酰化修飾后的多糖其清除自由基的能力均有所增加,且還原能力也比原多糖有所提高[20]。實(shí)驗(yàn)表明,隨著乙酰化程度的提高,乙?；瘶搴挚拙嗵堑目寡趸钚跃兴鰪?qiáng)。Yang等人對(duì)龍眼果實(shí)的果皮中的多糖進(jìn)行乙?；揎椦芯?發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性與乙酰基取代度有關(guān)[21]。這與本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。乙?；瘶搴挚拙嗵堑目寡趸钚栽鰪?qiáng),可能是由于引入乙酰基后,使多糖支鏈得到伸展,導(dǎo)致多糖羥基暴露,向外伸展,從而有利于捕捉自由基，提高其抗氧化活性[22]。
3 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)在氫氧化鈉的均相體系中,以不同體積的乙酸酐為?；噭?duì)樺褐孔菌進(jìn)行乙酰化修飾,調(diào)整反應(yīng)液的pH在一定的范圍內(nèi),獲得3個(gè)取代度分別為0.2810、0.3136、0.4072的乙?；瘶搴挚拙嗵?。進(jìn)一步進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)乙?；揎椇蟮臉搴挚拙嗵菍?duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除率相對(duì)樺褐孔菌多糖都有一定的提高。乙?；瘶搴挚拙嗵堑目寡趸钚耘c乙酰基取代度有關(guān)。本研究為樺褐孔菌多糖構(gòu)效關(guān)系研究提供了新的研究方向,為樺褐孔菌的化學(xué)修飾提供了重要的參考。
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