陳 鵬,顏 軍,梁 立,劉 嵬,茍小軍,何 鋼

(藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川抗菌素工業(yè)研究所,成都大學(xué),四川成都 610052)

銀耳(Tremellafuciformis)是銀耳科銀耳屬食用菌,具有滋陰潤肺、開胃健脾的功效[1],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,多糖是銀耳的主要活性成分,具有抗氧化、降血脂、抑菌等多種生物活性[2,3]。多糖的糖苷鍵種類、連接方式以及空間結(jié)構(gòu)會影響多糖的抗氧化、降血脂、免疫等生物活性[4]。由于多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,解析較為困難,多糖的構(gòu)、效關(guān)系研究進(jìn)展緩慢,常見的方法是將多糖進(jìn)行部分降解,解析活性結(jié)構(gòu)單元,以及對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾[5]。

常用的多糖的結(jié)構(gòu)修飾方法有甲基化、乙酰化、硫酸酯化、磷酸酯化等方法[6,7]。磷酸酯化修飾是指使多糖的羥基被磷酸酯基團(tuán)取代,已有研究表明,多糖磷酸酯化能夠增強(qiáng)多糖的部分生物活性[8]。如龍眼多糖磷酸酯化修飾后,能夠增強(qiáng)其抗腫瘤、抗菌活性[9];南瓜多糖磷酸酯化修飾后,增強(qiáng)了南瓜多糖的抗氧化活性[10]。銀耳多糖具有諸多生物活性,已有研究表明,銀耳多糖硫酸酯化、羧甲基化、乙酰化修飾能夠改善溶解性和增強(qiáng)活性,而磷酸酯化修飾研究報道較少。銀耳多糖相對分子質(zhì)量大、溶解性差[11],難以直接進(jìn)行磷酸酯化修飾。有研究表明,多糖經(jīng)部分降解后,溶解性會隨著分子量的降低而增強(qiáng)[12,13],因此可將銀耳多糖進(jìn)行部分降解,將獲得的低分子量銀耳多糖再進(jìn)行磷酸酯化修飾。

本文為以雙氧水-VC體系對銀耳多糖(Tremellapolysaccharide,TP)進(jìn)行氧化降解,得到降解銀耳多糖(DegradedTremellapolysaccharide,DTP),采用三氯氧磷和吡啶對其進(jìn)行磷酸酯化修飾,并測定修飾后的銀耳多糖(Phosphate degradedTremellapolysaccharide,PDTP)的抗氧化活性,旨在為后續(xù)深入研究銀耳多糖的構(gòu)效關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀耳子實(shí)體:通江銀耳 通江裕德源公司;乙醇、氯仿、正丁醇、三氯氧磷、磷酸二甲酯、硫酸、硝酸、雙氧水、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鉬酸銨、硫酸亞鐵、水楊酸 均為市售分析純;KBr 光譜純 成都市科龍化工試劑廠;葡聚糖(DextranT-10,40、70、500、2000)透析袋(3000 Da) 北京索萊寶科技有限公司。

L-2000液相色譜儀 日立科學(xué)儀器有限公司;紫外可見光分光光度儀 尤尼柯儀器有限公司;傅里葉紅外光譜儀 賽默飛公司;CT15RT型高速臺式冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;FD-1C-55型凍干機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀耳多糖的制備 參考文獻(xiàn)[14]方法,稱取100 g干燥銀耳粉,料液比1∶30 g/mL,提取溫度100 ℃,提取時間4 h,提取液8000 r/min離心10 min,取上清液濃縮,加入4倍體積無水乙醇過夜沉淀。8000 r/min離心10 min,收集多糖沉淀,加入100 mL蒸餾水復(fù)溶,8000 r/min離心10 min,除去沉淀,上清液用Sevage試劑除蛋白質(zhì)等雜質(zhì),直到溶液在蛋白質(zhì)最大吸收波長280 nm和核酸最大吸收波長254 nm處無吸收為止,透析48 h,將銀耳多糖溶液于-40 ℃真空冷凍干燥24 h,得到銀耳多糖(TP)。

1.2.2 銀耳多糖的氧化降解 參考Duan K等的方法[15],稱取1 g銀耳多糖于500 mL錐形瓶中,加100 mL蒸餾水使其溶解,加入100 mL VC溶液(10 mmol/L)、300 mL H2O2溶液(10 mmol/L),反應(yīng)2 h。將反應(yīng)液透析24 h,透析液7000 r/min離心10 min,將上清液于-40 ℃真空冷凍干燥24 h,獲得低分子量銀耳多糖樣品(DTP)。

1.2.3 銀耳多糖分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)測定。色譜條件:色譜柱為YMC PACK-Diol 200 ?(300 mm×8.0 mm ID,5 μm,20 nm),流動相為蒸餾水;流速0.8 mL/min,柱溫30 ℃;檢測器為示差折光檢測器;進(jìn)樣量20 μL。

將降解前后的多糖樣品及葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成5 mg/mL溶液,分別進(jìn)樣分析,求得線性方程。將降解前后多糖樣品的保留時間代入線性方程,計算多糖的相對分子質(zhì)量。

1.2.4 磷酸酯化銀耳多糖的制備 按照文獻(xiàn)[9]中的方法,稱取20 mg低分子量銀耳多糖于圓底燒瓶中,加蒸餾水5 mL、吡啶10 mL,冰浴下用6 mol/L氫氧化鈉溶液,調(diào)節(jié)pH至12。緩慢滴加三氯氧磷10 mL、磷酸三甲酯3 mL,隨后45 ℃水浴反應(yīng)4 h,反應(yīng)結(jié)束后,用4 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7,蒸餾水透析48 h,于-40 ℃真空冷凍干燥24 h,得到磷酸酯化銀耳多糖(PDTP)。

1.2.5 磷酸酯化銀耳多糖取代度的測定 移取不同濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL,依次加入鉬酸銨溶液4 mL和0.05 mol/L VC溶液2 mL。置于100 ℃水浴加熱10 min,隨后冷卻至室溫,以空白溶液為對照,于824 nm測吸光度值。以磷濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

取20 mg酯化銀耳多糖倒入消化瓶內(nèi),加入1.5 mL硫酸-硝酸混合溶液,逐漸加熱,待溶液變得澄清后,加入4.5 mL蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至7,并按上述磷標(biāo)準(zhǔn)溶液處理方法進(jìn)行處理,最后測得吸光度代入線性回歸方程,求得磷酸酯化多糖的磷含量。

式中,M為樣品中的磷含量(%)。

1.2.6 銀耳多糖水溶解度的測定 采用高速離心法[17]測定銀耳多糖的水溶解度,稱取60 mg DP、DTP、PDTP,加入1 mL蒸餾水溶解,15000 r/min離心10 min,移除上清液,將底部沉淀烘干至恒重,兩次重量之差即為銀耳多糖水溶解度。

1.2.7 銀耳多糖紅外光譜分析 稱取磷酸酯化修飾前后的銀耳多糖各5 mg,加入5 mg KBr研磨均勻,隨后取2 mg粉末壓片并進(jìn)行紅外光譜分析,掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.8 銀耳多糖抗氧化活性的測定

1.2.8.1 銀耳多糖羥自由基清除能力的測定 分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL TP、PDTP和DTP溶液各1.0 mL,加入FeSO4溶液2.0 mL、水楊酸-乙醇1.5 mL、H2O20.1 mL,混勻后,37 ℃反應(yīng)30 min,于510 nm處測量吸光度值。以1.0 mL蒸餾水代替多糖溶液作為空白對照[18]。

羥自由基清除率(%)=[(A0-As)/A0]×100

式中,A0為空白管的吸光度,As為加入樣品后的吸光度。

1.2.8.2 銀耳多糖DPPH自由基清除能力的測定 分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL TP、PDTP和DTP溶液各0.1 mL,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH(95%乙醇配制)溶液,渦旋混勻,避光37 ℃反應(yīng)30 min,離心10 min;取0.1 mL純水,加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混勻作空白對照?；靹蚝蟀堤幏磻?yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度值[19]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-As/A0)×100

式中,A0為空白管的吸光度,As為加入樣品后的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)操作3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳多糖的相對分子質(zhì)量分析

高效凝膠滲透色譜法(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)是測定樣品相對分子質(zhì)量的常用方法,銀耳多糖的相對分子質(zhì)量圖譜如圖1所示。以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖保留時間為橫坐標(biāo),相對分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,得線性回歸方程Y=-0.5609X+9.0527,r=0.9722(X為保留時間,Y為分子量對數(shù)),將降解前后樣品保留時間代入方程計算,降解前銀耳多糖的相對分子質(zhì)量范圍為40.27～65.33 kDa,降解產(chǎn)物經(jīng)透析后獲得一個單一組分,其相對分子量為7.82 kDa。

圖1 銀耳多糖的相對分子質(zhì)量圖譜Fig.1 Molecular weight chromatogram of Tremella polysaccharide

2.2 銀耳多糖的紅外光譜分析

紅外光譜是表征樣品特征吸收基團(tuán)的常用手段,銀耳多糖的紅外光譜圖如圖2所示。由圖2可知,3413.10 cm-1處的吸收峰是由多糖的羥基伸縮振動引起的;1670.35 cm-1處的吸收峰是多糖C=O伸縮振動峰,表明銀耳多糖中含有糖醛酸;1088.15 cm-1處的吸收峰是多糖C-O的變角振動吸收峰[20],這幾處吸收峰為銀耳多糖的特征吸收峰。與DTP譜圖相比,1262.22 cm-1處的吸收峰為P=O的特征吸收峰,540.55 cm-1處的吸收峰為磷酸酯鍵的特征吸收峰,表明銀耳多糖磷酸酯化成功。

圖2 銀耳多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of Tremella polysaccharide

2.3 磷酸酯化銀耳多糖取代度的測定結(jié)果

如圖3所示,磷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0517X+0.0073,r=0.9989(X為標(biāo)準(zhǔn)品磷的濃度,Y為吸光度)。在0～10 μg/mL范圍內(nèi),濃度與吸光度值線性關(guān)系良好。將樣品吸光度值代入曲線,計算后得出樣品的磷含量為0.41%,取代度Ds為0.021。

圖3 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of phosphorus

2.4 銀耳多糖水溶解度的測定結(jié)果

銀耳多糖水溶解試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知,降解前銀耳多糖的溶解度為15.33±1.51 mg/mL,降解后低分子量銀耳多糖的溶解度為30.45±1.23 mg/mL,磷酸酯化修飾后銀耳多糖的溶解度為42.71±1.67 mg/mL,表明氧化降解及磷酸酯化修飾能明顯改善銀耳多糖的水溶解度。

表1 銀耳多糖水溶解度Table 1 The water solubility of Tremella polysaccharide

2.5 銀耳多糖的抗氧化活性研究

2.5.1 銀耳多糖清除羥自由基的能力 多糖組分對羥自由基的清除率結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,隨著濃度增大,VC和各組分多糖對羥自由基的清除能力逐漸增強(qiáng),在2.4 mg/mL時,清除效率最高,VC清除率為99.6%,TP清除率為38.23%,DTP清除率為50.34%,PDTP清除率為67.45%。PDTP清除羥自由基的IC50為1.14 mg/mL,DTP清除羥自由基的IC50為2.35 mg/mL,而TP在最大濃度2.4 mg/mL時的清除率仍未達(dá)到50%。結(jié)果表明,TP、DTP、PDTP對羥自由基的清除效果隨濃度增加逐漸增強(qiáng)。多糖體外清除羥自由基的假設(shè)機(jī)理是羥自由基奪取銀耳多糖碳鏈上的活潑氫原子,與之結(jié)合成水;剩下的碳原子失去氫原子后成為碳自由基,進(jìn)一步氧化成過氧化自由基,最后分解成無害的物質(zhì)[21]。高分子量的銀耳多糖鏈之間相互纏繞、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,可被羥自由基獲取的氫原子數(shù)量少,經(jīng)過氧化降解后多糖鏈有部分?jǐn)嗔?水溶解度增加,被羥自由基獲取的氫原子數(shù)量增加[22,23],因此DTP對羥自由基的清除效果相比TP更好。據(jù)報道,黑加侖多糖[24]和龍須菜多糖[25]降解后對羥自由基的清除率顯著提高。對DTP進(jìn)行磷酸酯化修飾過后,引入的磷酸酯鍵改變了多糖原有的空間結(jié)構(gòu),PDTP的水溶解度為42.71±1.67 mg/mL,比TP、DTP更高,在反應(yīng)中可被羥自由基獲取的氫原子數(shù)更多,因此PDTP羥自由基的清除效果優(yōu)于DTP。

圖4 銀耳多糖對羥自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of Tremella polysaccharide

2.5.2 銀耳多糖清除DPPH自由基的能力 多糖組分對DPPH自由基的清除率結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,在0.4～2.4 mg/mL范圍內(nèi),VC對DPPH自由基清除率接近100%,三個多糖組分對DPPH自由基的清除能力均有劑量效應(yīng),濃度為2.4 mg/mL時,各多糖對DPPH自由基清除率最高,TP為37.15%,DT為65.24%,PDTP為73.77%。PDTP清除DPPH自由基的IC50為0.98 mg/mL,DTP清除DPPH自由基的IC50為2.05 mg/mL,而TP在最大濃度2.4 mg/mL時仍未達(dá)到50%清除率。結(jié)果表明,各濃度下對DPPH自由基的清除作用,PDTP>DTP>TP。DPPH自由基有單電子,自由基清除劑可與其單電子配對而使得紫外吸收逐漸消失[26]。對銀耳多糖進(jìn)行降解后,銀耳多糖鏈的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,水溶解度增加,DPPH自由基上孤對電子與多糖配對的空間位阻減小,采用三氯氧磷和吡啶體系對其進(jìn)行磷酸酯化后,DPPH自由基可進(jìn)一步奪取POCl2基團(tuán)上的電子[27],因此PDTP在各濃度下對DPPH自由基的清除作用最好。

圖5 銀耳多糖對DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH radical scavenging activity of Tremella polysaccharide

3 結(jié)論

本研究中銀耳多糖經(jīng)雙氧水-VC體系降解透析后,獲得一個單一組分,相對分子質(zhì)量為7.82 kDa;銀耳多糖的水溶解度為15.33±1.51 mg/mL,經(jīng)降解后增加到30.45±1.23 mg/mL,表明氧化降解能提高銀耳多糖的水溶解度;磷酸酯化銀耳多糖在1262.22、540.55 cm-1處出現(xiàn)了磷酸酯鍵吸收峰,采用磷鉬藍(lán)法測定樣品的取代度為0.021,證明磷酸基團(tuán)和銀耳多糖結(jié)合成酯,修飾后銀耳多糖的水溶解度提高為42.71±1.67 mg/mL。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,各濃度下的清除作用PDTP>DTP>TP,表明修飾后的低分子量銀耳多糖對自由基的清除效果良好。本文對銀耳多糖進(jìn)行降解和磷酸酯化,提高了多糖的水溶解度和抗氧化活性,但其作用機(jī)制還有待深入研究,本研究結(jié)果可為銀耳多糖的構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。