喬博鑫,邢紫娟,郭紅蓮

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lyclum)植物,在我國(guó)寧夏、甘肅、青海等地廣為種植[1-2],其果實(shí)含有多糖、脂類(lèi)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分,具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目等作用,深受人們喜愛(ài)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明,枸杞具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化和抗衰老等多種藥理功能[4]。作為傳統(tǒng)的藥食同源食品,枸杞的加工利用一直是人們關(guān)注和研究的重點(diǎn)。

乳酸菌是一類(lèi)能從發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌的統(tǒng)稱(chēng),可明顯改善食品風(fēng)味,提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3],同時(shí)乳酸菌又是具備多種功效的腸道有益菌,所以以枸杞為原料進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵,可能會(huì)產(chǎn)生許多美味又健康的食品。閻淳泰等[5]選用三種乳酸菌混合發(fā)酵枸杞汁72 h,得到了既有益生菌活力又有枸杞風(fēng)味的乳酸菌飲料,郭紅轉(zhuǎn)[6]以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵枸杞汁與牛乳混合液,得到枸杞乳飲料;此外還有人用葡萄糖酵母、嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵枸杞葉浸提漿,研制出口感獨(dú)特的枸杞茶[7]等,這些研究在一定程度上揭示了乳酸菌類(lèi)發(fā)酵枸杞的研究已引起人們的關(guān)注,但這些報(bào)導(dǎo)多是針對(duì)枸杞乳酸菌發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行的研究,而發(fā)酵后產(chǎn)品的風(fēng)味成分及相關(guān)生理活性改變等方面的報(bào)導(dǎo)還較少。

本文以枸杞干果為原料,選用保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus,簡(jiǎn)稱(chēng)L.b)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus,簡(jiǎn)稱(chēng)S.t)為微生物菌種對(duì)枸杞果榨汁進(jìn)行發(fā)酵,研究了具有枸杞特有風(fēng)味的乳酸菌飲料的發(fā)酵工藝條件,以便充分保存枸杞的有效成分和營(yíng)養(yǎng)功效,滿(mǎn)足消費(fèi)者的口味和健康需求,同時(shí)對(duì)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的枸杞汁生理成分及風(fēng)味物質(zhì)變化進(jìn)行了探討,確定其營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味的變化趨勢(shì),為枸杞發(fā)酵汁飲料的功能開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)參考,同時(shí)為枸杞相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù),對(duì)提高水果附加值等均具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧杞1號(hào)枸杞果實(shí) 寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究所提供;保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus,簡(jiǎn)稱(chēng)L.b)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus,簡(jiǎn)稱(chēng)S.t) 天津科技大學(xué)菌種保藏中心;氫氧化鈉 天津市化學(xué)試劑廠;葡萄糖 天津市大茂化學(xué)試劑廠;考馬斯亮藍(lán)G-250、3,5-二硝基水楊酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JYL-C010榨汁機(jī) 青島九陽(yáng)世家電器有限公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;MP522精密酸度計(jì) 上海三信儀表廠;PAL-1糖度計(jì) 日本愛(ài)拓公司;GCMS-QP2010Ultral氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌菌懸液的制備 在無(wú)菌環(huán)境下,將保藏的菌粉接種于固體培養(yǎng)基上活化2次后,挑取平板上單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)24 h后,在4000 r/min條件下離心20 min,棄上清保留菌體。將菌體用無(wú)菌生理鹽水清洗3次后,與無(wú)菌生理鹽水混合,配制成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 發(fā)酵工藝 工藝流程:

工藝要點(diǎn):

前處理:剔除壞果、雜質(zhì),選取大小一致、色澤飽滿(mǎn)、無(wú)機(jī)械損傷的干枸杞。

浸泡:冷水浸泡3 h。

打漿:將浸泡過(guò)的枸杞以一定量的料液比在榨汁機(jī)中打漿,使之成為枸杞液。

殺菌:90～95 ℃,30 s瞬時(shí)殺菌。

接種:將培養(yǎng)好的L.b、S.t菌按照1∶1體積混合后,在無(wú)菌操作下接種于枸杞液中。

發(fā)酵:選擇合適的接種量添加到枸杞液中,在37 ℃條件下發(fā)酵。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),確定以料液比、發(fā)酵時(shí)間、接種量為三個(gè)主要影響因素,以感官評(píng)價(jià)值為測(cè)試指標(biāo),確定發(fā)酵因素水平。

料液比:L.b、S.t按1∶1體積混合后,以3%接種量分別加入到料液比為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1和14∶1 (g/100 mL)的枸杞液中,在37 ℃條件下恒溫發(fā)酵24 h后,測(cè)定不同料液比的產(chǎn)酸量與感官評(píng)價(jià)值。

發(fā)酵時(shí)間:L.b、S.t按1∶1 (V/V)混合后,以3%接種量加入到料液比為8∶1 g/100 mL的枸杞液中,在37 ℃條件下分別發(fā)酵4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 h后,測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)酸量與感官評(píng)價(jià)值。

接種量:將L.b、S.t按1∶1體積混合后分別以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量加入到料液比8∶100 g/mL的枸杞液中,在37 ℃條件恒溫發(fā)酵24 h后,測(cè)定不同接種量的產(chǎn)酸量與感官評(píng)分值。

1.2.4 正交試驗(yàn) 以料液比、發(fā)酵時(shí)間、接種量為影響因素,采用正交試驗(yàn)優(yōu)化枸杞榨汁的發(fā)酵工藝,以感官評(píng)分值為指標(biāo),確定最佳發(fā)酵條件,因素和水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 枸杞發(fā)酵工藝的試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for fermentation process of Lycium barbarum

1.2.5 感官評(píng)分 選取食品學(xué)院無(wú)飲食偏好的師生共9人組成評(píng)價(jià)小組,對(duì)發(fā)酵液的口感、外觀、色澤、風(fēng)味賦分,按照表2對(duì)發(fā)酵汁進(jìn)行感官評(píng)定,每個(gè)測(cè)試樣品的感官評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)去掉最高和最低評(píng)分后取算術(shù)平均值。

表2 枸杞發(fā)酵液的感官評(píng)定表Table 2 Sensory evaluation of the fermented broth of Lycium barbarum

1.2.6 枸杞液發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)分析 采用正交試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵條件對(duì)枸杞進(jìn)行發(fā)酵,在37 ℃條件下每隔4 h測(cè)定以下指標(biāo):活菌數(shù):參照GB4789.35-2016方法[8]進(jìn)行;pH:利用酸度計(jì)測(cè)定;可滴定酸測(cè)定:按照GB/T12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定[9];還原糖含量:利用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[10];可溶性固形物:利用糖度計(jì)測(cè)定;可溶性蛋白:利用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[11]。

1.2.7 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 參照固相微萃取的方法,以GC-MS聯(lián)用儀測(cè)定發(fā)酵后的風(fēng)味物質(zhì)[12]。樣品以Rtx-5MS萃取頭于60 ℃吸附萃取40 min,進(jìn)樣口解吸15 min。GC/MS-QP2010聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè),進(jìn)樣口溫度250 ℃,進(jìn)樣方式:分流,分流比:10∶1,載氣為He,純度99.99%。全掃描范圍30～550 m/z,溶劑延遲時(shí)間1.5 min。檢測(cè)結(jié)果在NIST譜庫(kù)檢索,將匹配度大于80%的化合物作為暫定結(jié)果,查閱資料進(jìn)行結(jié)果比對(duì),以確定最終檢測(cè)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Excel、SPSS 25.0及GraphPad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸發(fā)酵枸杞工藝

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 接種量料液比和發(fā)酵時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3,各因素對(duì)感官評(píng)分值均具有顯著性影響(p<0.05)。當(dāng)料液比為8∶1 g/100 mL時(shí),發(fā)酵液的感官評(píng)分值最佳(圖1),乳酸菌發(fā)酵枸杞液的最適時(shí)間為24 h(圖2),枸杞發(fā)酵液的感官評(píng)分值在接種量為3%時(shí)達(dá)最佳(圖3)。

圖1 料液比對(duì)發(fā)酵液感官品質(zhì)的影響結(jié)果Fig.1 Effects of material liquid ratio on sensory quality of fermentation broth 注:不同小寫(xiě)字母代表差異顯著,p<0.05,圖2～圖3同。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液感官品質(zhì)的影響結(jié)果Fig.2 Effects of fermentation time on sensory quality of the fermented broth

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵液感官品質(zhì)的影響結(jié)果Fig.3 Effects of inoculum on sensory quality of fermentation broth

2.1.2 正交優(yōu)化結(jié)果 以枸杞發(fā)酵后的感官評(píng)分為指標(biāo),確定了影響枸杞發(fā)酵液的感官品質(zhì)因素順序?yàn)?發(fā)酵時(shí)間>接種量>料液比,最佳發(fā)酵條件為A2B2C3,即枸杞發(fā)酵飲料的工藝條件為接種量4%,料液比8∶1 g/100 mL,發(fā)酵時(shí)間24 h(表3),該條件下感官評(píng)分值為81分。

表3 枸杞發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of fermented Lycium barbarum

對(duì)上述工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性發(fā)酵,結(jié)果確定發(fā)酵液口感酸甜,有枸杞特有的風(fēng)味,感官評(píng)分為81分,與正交試驗(yàn)結(jié)果相符。

對(duì)感官評(píng)分進(jìn)行方差分析(表4)可知,發(fā)酵時(shí)間對(duì)枸杞發(fā)酵液感官評(píng)分的影響具有極顯著性差異(p<0.01),料液比和接種量對(duì)枸杞發(fā)酵液感官評(píng)分有顯著性影響(p<0.05)。

表4 感官評(píng)分方差分析Table 4 Variance analysis of sensory scores

2.2 乳酸發(fā)酵枸杞過(guò)程中理化指標(biāo)的變化

2.2.1 乳酸菌數(shù)量的動(dòng)態(tài) 發(fā)酵液中的菌體數(shù)量在0～20 h內(nèi)迅速增加(圖4),這可能是由于乳酸菌利用發(fā)酵液中的可發(fā)酵糖等充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖和代謝的結(jié)果[13]。20 h后,活菌菌數(shù)上升趨勢(shì)減慢,乳酸菌緩慢生長(zhǎng),進(jìn)入穩(wěn)定期。發(fā)酵28 h后,發(fā)酵液中的活菌數(shù)開(kāi)始緩慢減少;發(fā)酵28～40 h內(nèi),發(fā)酵液中活菌數(shù)減少的速度呈慢-快-慢的趨勢(shì),這可能由于發(fā)酵飲料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)多,產(chǎn)酸過(guò)多抑制了菌種的繁殖,菌種進(jìn)入衰退期。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)變化曲線(xiàn)Fig.4 Change curve of viable cell count during fermentation

2.2.2 發(fā)酵液酸度的變化 由圖5可以看出,隨發(fā)酵時(shí)間的不斷進(jìn)行,發(fā)酵液中pH逐漸降低,可能是乳酸菌利用自身酶類(lèi)物質(zhì)使枸杞液中的碳水化合物和脂肪降解成有機(jī)酸或者脂肪酸[14]。當(dāng)pH降至3.6(36 h)左右時(shí),pH趨于穩(wěn)定狀態(tài),這是因?yàn)榘l(fā)酵液中代謝產(chǎn)物積累,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中pH的變化Fig.5 Changes in pH during fermentation

2.2.3 發(fā)酵過(guò)程中可滴定酸的變化 酸度是衡量枸杞發(fā)酵飲料品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖6在乳酸菌發(fā)酵枸杞榨汁的過(guò)程中,在發(fā)酵24 h前,發(fā)酵液中可滴定酸快速增加,24 h時(shí)枸杞液的酸度達(dá)到62.60 °T。由于乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中利用枸杞中的單糖、多糖等碳水化合物產(chǎn)生乳酸、乙酸等[15],這些有機(jī)酸既提高了枸杞發(fā)酵飲料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),又形成了枸杞發(fā)酵飲料的風(fēng)味,還具有一定的抑菌效果,對(duì)枸杞發(fā)酵飲料的生產(chǎn)具有重要影響。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中可滴定酸的變化Fig.6 Changes of titratable acid during fermentation

2.2.4 發(fā)酵過(guò)程中還原糖的變化 枸杞液初始還原糖含量為2.790 mg/mL,發(fā)酵時(shí)間8 h內(nèi)還原糖的含量變化趨勢(shì)緩慢(如圖7)。8 h后隨著發(fā)酵的進(jìn)行,枸杞液中的還原糖含量迅速降低,這可能是因?yàn)槿樗峋描坭揭褐械膯熙?轉(zhuǎn)化為低分子的乳酸或乙酸。發(fā)酵28 h后,枸杞液中的還原糖降低到0.267 mg/mL,隨后變化趨于平緩,說(shuō)明還原糖已經(jīng)基本被消耗。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化Fig.7 Change of reducing sugar content during fermentation

2.2.5 發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物的變化 從圖8可以看出,在0～8 h內(nèi)枸杞發(fā)酵液中的可溶性固形物逐漸增加,這是由于發(fā)酵過(guò)程中枸杞中的內(nèi)部物質(zhì)溶出,使得可溶性固形物增多。在8～20 h中枸杞發(fā)酵液中的可溶性固形物快速減少,因?yàn)槿樗峋诜敝尺^(guò)程中大量消耗碳水化合物。在20～32 h中枸杞發(fā)酵液中的可溶性固形物緩慢減少,這是因?yàn)槿樗峋脑鲋尺M(jìn)入平穩(wěn)期。在32～40 h中枸杞發(fā)酵液中的可溶性固形物含量逐漸趨于平穩(wěn),這是因?yàn)槿樗峋脑鲋尺M(jìn)入衰退期。

圖8 發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物的變化Fig.8 Changes of soluble solids during fermentation

2.2.6 發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白含量的變化 在乳酸菌發(fā)酵枸杞液過(guò)程中,時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中的可溶性蛋白含量有明顯影響(如圖9)。由圖9可知,在0～24 h內(nèi)枸杞發(fā)酵液中的可溶性蛋白含量明顯增多,這是由于在發(fā)酵過(guò)程中,菌體會(huì)產(chǎn)生蛋白酶,在蛋白酶的作用下發(fā)酵液中的蛋白含量逐漸升高。發(fā)酵24 h后枸杞發(fā)酵液中蛋白含量迅速降低,這是由于可溶性蛋白會(huì)逐漸分解為具有多種香氣的氨基酸,以維持乳酸菌自身的生長(zhǎng)。

圖9 發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.9 Changes in soluble protein content during fermentation

2.3 發(fā)酵前后枸杞飲料中風(fēng)味物質(zhì)分析

香氣成分是檢測(cè)發(fā)酵飲料風(fēng)味的主要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)使用GC-MS技術(shù)分離鑒定枸杞液發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分。圖10～圖11分別為枸杞液發(fā)酵前后香氣成分總離子流圖，鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可知,未發(fā)酵枸杞液中分析出32種成分,包括1種酯類(lèi)、12種醛類(lèi)、8種酮類(lèi)、11種醇類(lèi)共4類(lèi)物質(zhì);發(fā)酵后的枸杞液中分析出63種化合物,主要的揮發(fā)物質(zhì)包括12種酯類(lèi)、16種醛類(lèi)、15種酮類(lèi)、13種醇類(lèi)、4種酸類(lèi)、芳香雜環(huán)類(lèi)3種共6類(lèi)物質(zhì)。未發(fā)酵的枸杞液中,醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量高,對(duì)未發(fā)酵枸杞的風(fēng)味貢獻(xiàn)大。如壬醛有明顯的油脂氣味和甜橙氣息,己醛具有天然的水果香氣及青草、油脂氣味。1-戊烯-3-醇、己醇、1-辛醇、1-壬醇、3-甲基-1-丁醇賦予枸杞一種令人愉快的氣味,如1-戊烯-3-醇是存在于橙子、草莓、番茄等水果中的一種果香。酮類(lèi)使未發(fā)酵枸杞飲料表現(xiàn)出獨(dú)特的風(fēng)味,如2,3-丁二酮會(huì)有濃郁的奶油香味。

圖10 枸杞未發(fā)酵液的香氣成分總離子流圖Fig.10 Total ion currents of aroma components of unfermented beverage of Lycium barbarum

圖11 枸杞發(fā)酵液的香氣成分總離子流圖Fig.11 Total ion currents of aroma components of fermented beverage of Lycium barbarum

表5 枸杞發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 5 GC-MS analysis of volatile components of Lycium barbarum before and after fermentation

續(xù)表

發(fā)酵后的枸杞液中,醇類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量較高。與發(fā)酵前相比,發(fā)酵后的枸杞液中,醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量均有改變,正己醇成為枸杞發(fā)酵液的主要風(fēng)味物質(zhì),具有果子香氣。酯類(lèi)物質(zhì)含量明顯增加,酯類(lèi)物質(zhì)具有成熟果香味或堅(jiān)果味,對(duì)發(fā)酵液的整體風(fēng)味具有促進(jìn)作用,不同的酸和醇結(jié)合產(chǎn)生多種類(lèi)具有不同香味的酯類(lèi),也是香氣成分的主要組成。酮類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量明顯下降,醛類(lèi)是枸杞發(fā)酵液中的主要風(fēng)味成分,給枸杞液帶來(lái)獨(dú)特的花香味。新增少量酸類(lèi)、芳香雜環(huán)類(lèi)物質(zhì),酸類(lèi)物質(zhì)可以使產(chǎn)品具有酸味感。呋喃類(lèi)化合物具有水果香、焦糖香、烤香味,也是發(fā)酵產(chǎn)品的重要風(fēng)味物質(zhì)。

綜合上述,經(jīng)發(fā)酵后的枸杞揮發(fā)性化合物的種類(lèi)明顯增多,說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中增加了枸杞發(fā)酵液的風(fēng)味。

注：-代表在未發(fā)酵枸杞液中未檢出。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究了乳酸菌發(fā)酵枸杞的工藝,確定了選用保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌為菌種時(shí)的發(fā)酵工藝:接種量4%,料液比8∶1 g/100 mL、發(fā)酵時(shí)間24 h。該工藝下乳酸菌發(fā)酵枸杞過(guò)程中可滴定酸逐漸上升，pH及還原糖含量不斷下降，活菌數(shù)、可溶性固形物含量、可溶性蛋白含量呈先升后降的趨勢(shì)。通過(guò)發(fā)酵,產(chǎn)生了新的香氣成分,枸杞發(fā)酵液中酯類(lèi)成分明顯增加,另外還發(fā)現(xiàn)了3種芳香雜環(huán)類(lèi)物質(zhì),因此,枸杞發(fā)酵液中呈香物質(zhì)的明顯增多,可能是其風(fēng)味更為獨(dú)特的原因。

枸杞汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后其活菌數(shù)增加,風(fēng)味大大改善,這類(lèi)食品往往由一般的營(yíng)養(yǎng)食品發(fā)展成為具有特殊效果的功能性食品,因而對(duì)其功能成分和風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行深入研究,對(duì)于增加枸杞果實(shí)的綜合利用有重要意義。