宋永安，張雪燕，徐志偉，張曉菊

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科(鄭州 450000)

肺癌是常見的惡性腫瘤，病死率高，5年生存率<15%[1]。由于肺癌患病因素多、預(yù)后差，其治療難度較大。目前，最常見的肺癌類型是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，約占所有肺癌的85%[2-3]。新發(fā)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中約40%為臨床Ⅳ期肺癌，姑息性化療的中位生存期僅為8～11個(gè)月，發(fā)生轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌通常被認(rèn)為無法治愈[4]。因此，尋找更好的臨床療法來治療肺癌非常迫切。安羅替尼是我國(guó)正大天晴藥業(yè)集團(tuán)自主研發(fā)的一種新型小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑[5]，能有效抑制VEGFR、PDGFR等激酶[6]，具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，目前多種癌癥臨床試驗(yàn)正在開展當(dāng)中[7-8]。肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌患者高病死率的主要原因，尋找更好的方法抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移一直是肺癌治療研究的重點(diǎn)[9]。A549細(xì)胞系是體外最常見的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，本研究首次發(fā)現(xiàn)安羅替尼在體外能夠抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移侵襲，有望為治療非小細(xì)胞肺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)；安羅替尼購(gòu)自MCE有限公司(美國(guó))；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自BI公司(以色列)；CCK8試劑購(gòu)自日本同仁有限公司(日本)；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物有限公司(中國(guó))；Transwell小室購(gòu)自康寧公司(美國(guó))；細(xì)胞培養(yǎng)皿和細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自耐思生物科技公司(無錫)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清。所有細(xì)胞約4 d傳代1次，隔1 d更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋后均勻加至96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為3 500個(gè)。24 h后，加入含不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)安羅替尼的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，另外設(shè)置不加安羅替尼的陰性對(duì)照組。安羅替尼作用24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育4 h，然后用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(n=3)。按照CCK8試劑盒說明書計(jì)算各組中A549細(xì)胞的生存率。

1.2.3 安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 將消化下來的A549細(xì)胞以每孔5×105細(xì)胞接種于6孔板，過夜后加入含有不同濃度(0、4、8、16 μmol/L)安羅替尼的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。用不含EDTA的胰酶消化A549細(xì)胞，并用遇冷的PBS洗滌3次，收集細(xì)胞。在每組細(xì)胞中先加入5 μL Annexin V-FITC和500 μL緩沖液，混勻后再加入5 μL PI溶液。充分混勻后在室溫避光染色20 min。用流式細(xì)胞儀器收集1萬個(gè)細(xì)胞，根據(jù)試劑盒染色情況分析細(xì)胞凋亡情況(n=3)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力 A549細(xì)胞以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中，等到細(xì)胞長(zhǎng)至約90%時(shí)，用無菌200 μL槍頭沿孔板中央劃一條直線，PBS清洗后，用含有不同濃度(0、1、2、4 μmol/L)安羅替尼的無血清培養(yǎng)基分組培養(yǎng)。分別在0、48 h用顯微鏡拍照，劃痕寬度用ImageJ軟件計(jì)算(n=3)。遷移率=1-48 h的劃痕寬度/0 h的劃痕寬度×100%。

1.2.5 Transwell細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 先在24孔板各孔中加600 μL含20%血清的培養(yǎng)基，然后取出Transwell侵襲小室，放入24孔板各孔中，在Transwell小室內(nèi)加入基質(zhì)膠。等到基質(zhì)膠凝固后將消化下來的A549細(xì)胞按每孔5×104個(gè)細(xì)胞接入Transwell小室，分組培養(yǎng)，小室中加入無血清培養(yǎng)基，使終體積為400 μL。Transwell小室和24孔板中均含有相同濃度的安羅替尼。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基。取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)未穿過的細(xì)胞。24孔板中加4%多聚甲醛，并將Transwell小室浸入，室溫固定15 min，PBS清洗3次。移去小室，倒置風(fēng)干。然后在24孔板中加入配置好的700 μL dipy溶液，將小室浸入其中，室溫避光染色15 min。取出小室，用PBS清洗3遍，并在顯微鏡下觀察(n=3)。每個(gè)小室取3個(gè)不同視野進(jìn)行拍照，ImageJ軟件計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 安羅替尼抑制A549細(xì)胞增殖

安羅替尼能抑制A549細(xì)胞的增殖(圖1)，A549細(xì)胞的抑制率隨著安羅替尼濃度的增加而增加，且安羅替尼作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)，顯示出了時(shí)間依賴性。24 h的IC50值為43.82 μmol/L，48 h的IC50值為13.27 μmol/L，72 h的IC50值為6.47 μmol/L，顯示出了良好的細(xì)胞增殖抑制作用(表1)。

表1 安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

注：與0 μmol/L安羅替尼組比較，*P<0.05，與0 μmol/L安羅替尼組比較，**P<0.01

2.2 安羅替尼促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)處理48 h后A549細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有升高，其中晚期凋亡率比早期凋亡率升高的更顯著(表2、圖2)，說明安羅替尼可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡來降低A549細(xì)胞的生存率。

表2 安羅替尼促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡

注：與0 μmol/L安羅替尼組相比，*P<0.05，與0 μmol/L安羅替尼組相比，**P<0.01

圖2 安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

2.3 安羅替尼抑制A549細(xì)胞遷移

各組細(xì)胞在0 h和安羅替尼處理后48 h用顯微鏡拍照觀察細(xì)胞遷移情況。安羅替尼作用后A549細(xì)胞遷移能力降低，并且隨著安羅替尼濃度增加，細(xì)胞遷移率逐漸降低(圖3)，說明安羅替尼以濃度依賴的方式抑制A549細(xì)胞遷移。

圖3 安羅替尼抑制A549細(xì)胞遷移注：A：劃痕實(shí)驗(yàn)遷移圖(光學(xué)顯微鏡，×10)；B：各組的遷移率。兩兩比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 安羅替尼抑制A549細(xì)胞侵襲

用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響，觀察到安羅替尼作用48 h后，穿過Transwell小室膜的細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組減少(圖4)，說明A549細(xì)胞的侵襲能力受到抑制且安羅替尼濃度越高，侵襲抑制作用越強(qiáng)。

圖4 不同濃度安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響注：A：Transwell圖(光學(xué)顯微鏡，×20)；B：各組中單個(gè)視野平均細(xì)胞數(shù)。兩兩比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肺癌是危害人類健康的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例的80%以上，目前整體5年生存率<15%[10]。肺癌的特征在于細(xì)胞不受控制的增殖，最常見的是上皮細(xì)胞(癌)[11]?；加型砥贜SCLC的患者平均在診斷后18個(gè)月內(nèi)死亡，轉(zhuǎn)移性傳播占死亡病例的70%以上[12]。肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是肺癌患者高病死率的最主要原因，因此抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移是肺癌治療的重點(diǎn)。

A549細(xì)胞是體外實(shí)驗(yàn)常用的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，本研究首次發(fā)現(xiàn)安羅替尼能抑制非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549增殖、遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞的增殖往往與抵抗凋亡有關(guān)，腫瘤細(xì)胞可通過各種途徑逃避凋亡，使正常的凋亡通路失去功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和增殖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖具有強(qiáng)烈的抑制作用，72 h的IC50值僅為6.47 μmol/L。本研究又用凋亡雙染法檢測(cè)了A549細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)安羅替尼濃度依賴性(4、8、16 μmol/L)地增加A549細(xì)胞凋亡比例，說明抑制A549細(xì)胞增殖作用與促進(jìn)其凋亡有關(guān)。

楊斌等[14]發(fā)現(xiàn)安羅替尼能夠抑制肝癌細(xì)胞HCCC-9810的轉(zhuǎn)移與侵襲。平板劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)可評(píng)價(jià)細(xì)胞在體外的遷移、侵襲能力，平板劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)安羅替尼在低于IC50濃度時(shí)(1、2、4 μmol/L)便可以抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲，用4 μmol/L安羅替尼處理，A549細(xì)胞幾乎失去侵襲能力。

綜上所述，安羅替尼是我國(guó)自主研發(fā)的靶向藥，副作用小，該實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了安羅替尼在體外對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549增殖、遷移侵襲的抑制作用，有望為安羅替尼治療非小細(xì)胞肺癌提供新的理論基礎(chǔ)。