劉月波 章小敏 洪 冰 陳 將 何 昱

1 浙江省三門縣中醫(yī)院 浙江 三門 317100

2 浙江省三門縣人民醫(yī)院 浙江 三門 317100

3 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

我國中藥飲片的年產(chǎn)量以14%～28%的速度遞減[1]，在此背景下，中藥配方顆粒劑應(yīng)運(yùn)而生，后者具有免煎煮、攜帶及服用方便、運(yùn)輸方便、起效迅速等優(yōu)點。但中藥配方顆粒劑是將單味中藥“分煎”后合并，缺少藥物共煎環(huán)節(jié)，藥物間不會發(fā)生煎煮過程中的互相作用。中藥配方顆粒和傳統(tǒng)湯劑制備和使用過程中的差異，是否會導(dǎo)致兩者在化學(xué)成分及藥效作用等存在差異性，成為研究重點。本實驗選擇辛溫發(fā)汗的代表方劑麻黃湯為對象，通過小鼠腋窩部皮膚汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑的大小，比較麻黃湯及其拆方傳統(tǒng)飲片湯劑與配方顆粒湯劑的藥效差異，為配方顆粒的臨床使用提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器：JA2003N型FA/JA電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；NY2513型油汀取暖器（美的）；組織包埋機(jī)（德國Leica）；自動染色機(jī)德國（德國Leica）；超薄切片機(jī)（德國Leica）；濱松NanoZoomer數(shù)字病理切片掃描儀（NDP）；小鼠灌胃器；燒杯；量桶等。

1.2 材料：分述如下。

1.2.1 動物：健康昆明種小鼠，SPF級，體重約18～22g，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號為SCXK（滬）2013-0018，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)[SYXK（浙）2013-0184] 。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度22±1℃，濕度50%～60%，光照每12h明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h。

1.2.2 藥品：麻黃藥材（批號：160801）、桂枝藥材（批號：151001）、苦杏仁藥材（批號：160701）、炙甘草藥材（批號：160801）、麻黃顆粒（批號：5120053）、桂枝顆粒（批號：5122633）、苦杏仁顆粒（批號：5125543）、炙甘草顆粒（批號：6020433）均由廣東一方制藥有限公司提供。每克麻黃顆粒相當(dāng)于臨床使用量飲片10.0g，每克桂枝顆粒相當(dāng)于臨床使用量飲片12.0g，每克苦杏仁顆粒相當(dāng)于臨床使用量飲片14.3g，每克炙甘草顆粒相當(dāng)于臨床使用量飲片5.0g。中藥飲片由浙江中醫(yī)藥大學(xué)資源與鑒定教研室張水利教授鑒定，麻黃為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf的干燥草質(zhì)莖，苦杏仁為薔薇科植物山杏Prunus armeniaceL.var.ansu Maxim的干燥成熟種子，桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥嫩枝，炙甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗分組：將190只小鼠按體重隨機(jī)分為19組，每組10只，雌雄各半，分別為飲片湯劑組9組、配方顆粒組9組和空白組1組。有研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁和炙甘草無發(fā)汗作用[3]，為了解配伍對小鼠發(fā)汗作用的影響，故本實驗將飲片湯劑組分為：①麻黃飲片9g+桂枝飲片6g+苦杏仁飲片6g+炙甘草飲片3g組即麻黃湯全方飲片湯劑組（簡稱麻黃湯飲片組），②麻黃飲片9g+桂枝飲片6g+苦杏仁飲片6g組（簡稱麻桂杏飲片組），③麻黃飲片9g+桂枝飲片6g+炙甘草飲片3g組（簡稱麻桂甘飲片組），④麻黃飲片9g+苦杏仁飲片飲片6g組（簡稱麻杏飲片組），⑤麻黃飲片9g+炙甘草飲片飲片3g組（簡稱麻甘飲片組），⑥麻黃飲片9g+苦杏仁飲片6g+炙甘草飲片3g組（簡稱麻杏甘飲片組），⑦桂枝飲片6g+苦杏仁飲片6g組（簡稱桂杏飲片組），⑧桂枝飲片6g+炙甘草飲片3g組（簡稱麻甘飲片組），⑨桂枝飲片6g+苦杏仁飲片6g+炙甘草飲片3g組（簡稱桂杏甘飲片組）。按相同的原生藥量計，配方顆粒湯劑組相應(yīng)地分為：①麻黃顆粒0.9g+桂枝顆粒0.5g+苦杏仁顆粒0.42g+炙甘草顆粒0.6g組即麻黃湯全方配方顆粒組（簡稱麻黃湯顆粒組），②麻黃顆粒0.9g+桂枝顆粒0.5g+苦杏仁顆粒0.42g組（簡稱麻桂杏顆粒組），③麻黃顆粒0.9g+桂枝顆粒0.5g+炙甘草顆粒0.6g組（簡稱麻桂甘顆粒組），④麻黃顆粒0.9g+苦杏仁顆粒0.42g組（簡稱麻杏顆粒組），⑤麻黃顆粒0.9g+炙甘草顆粒0.6g組（簡稱麻甘顆粒組），⑥麻黃顆粒0.9g+苦杏仁顆粒0.42g+炙甘草顆粒0.6g組（簡稱麻杏甘顆粒組），⑦桂枝顆粒0.5g+苦杏仁顆粒0.42g組（簡稱桂杏顆粒組），⑧桂枝顆粒0.5g+炙甘草顆粒0.6g組（簡稱桂甘顆粒組），⑨桂枝顆粒0.5g+苦杏仁顆粒0.42g+炙甘草顆粒0.6g組（簡稱桂杏甘顆粒組）。

2.2 供試品溶液的制備：分述如下。

2.2.1 麻黃湯傳統(tǒng)飲片湯劑的制備：精密稱取麻黃飲片9g，桂枝飲片、苦杏仁飲片各6g，炙甘草飲片3g，置于密閉容器中，加入10倍量的水常溫浸泡30min，75℃水浴40min，抽濾，藥渣再加入10倍量的水，75℃水浴40min，合并濾液，得濾液480ml。制備后的溶液濃縮至每ml含生藥材1g。

2.2.2 麻黃湯配方顆粒湯劑的制備：稱取與上述處方飲片藥材量相當(dāng)?shù)闹兴幣浞筋w粒，即精密稱取麻黃顆粒0.9g，桂枝顆粒0.5g，苦杏仁顆粒0.42g，炙甘草顆粒0.6g，加入20倍量水，75℃水浴至完全溶解，得濾液48.4ml。制備后的溶液濃縮至每ml含生藥材1g。按照“2.2.1、2.2.2”項，分別稱取實驗分組中傳統(tǒng)飲片湯劑和配方顆粒湯劑處理下②～⑨組，加入相應(yīng)倍數(shù)的水，制備各配伍下的供試品溶液。

2.3 小鼠汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑試驗：本實驗在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心進(jìn)行，所有實驗動物的使用均遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定，并接受其監(jiān)督。19組實驗小鼠，共190只，實驗前禁食8h（不禁水）。18組試驗組分別灌胃給藥，每只小鼠灌胃給藥1ml制備的溶液?？瞻讓φ战M給予等體積的生理鹽水。給藥60mim后，頸椎脫臼處死動物，切取小鼠腋窩部皮膚，4%甲醛固定，固定3天后，常規(guī)石蠟包埋；乙醇梯度脫水；二甲苯透明；石蠟包埋組織；切片；IE染色，封片后在顯微鏡下觀察汗腺，選取10條汗腺導(dǎo)管，測量導(dǎo)管內(nèi)徑，其平均值即為小鼠腋窩部皮膚汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑[3]。各組小鼠腋窩皮膚汗腺導(dǎo)管組織切片HE染色圖見圖1。從圖中可以看出，與空白組相比，各實驗組小鼠的腋窩皮膚導(dǎo)管內(nèi)徑都有所擴(kuò)張。

圖1 不同處理下小鼠腋窩皮膚汗腺導(dǎo)管組織切片

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：兩兩比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01為其差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計。在顯微鏡下選取10條汗腺導(dǎo)管，測量導(dǎo)管內(nèi)徑，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 不同處理下小鼠腋窩皮膚汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑（±s，μm，n=10）

表1 不同處理下小鼠腋窩皮膚汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑（±s，μm，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；相同配伍顆粒組與飲片組間比較，△P＜0.05。

配方顆粒湯劑組12.350±0.48 73.825±16.71**△37.625±2.33***33.600±3.12***22.075±1.21***29.125±4.06**41.150±3.00***△32.600±2.61***66.750±1.46***17.425±0.53***組別空白組麻黃湯全方麻杏組合麻甘組合桂甘組合桂杏組合麻桂甘組合麻杏甘組合麻桂杏組合桂甘杏組合傳統(tǒng)飲片湯劑組12.350±0.48 106.525±6.96***47.475±8.96**33.825±3.71***21.975±1.89**28.400±5.30**63.275±11.97**33.825±3.43**66.325±7.74***18.875±1.76**

3 分析與討論

為排除因藥材產(chǎn)地、批次等質(zhì)量的不同而引起的差異，保證實驗結(jié)果更具科學(xué)性，本次實驗中所用的配方顆粒的生產(chǎn)原料藥與實驗中所用的飲片藥材為同產(chǎn)地、同批次藥物。

目前發(fā)汗實驗的檢測方法有：著色法，定量測量法，皮膚電生理方法，皮毛觀察法，觀察汗腺上皮細(xì)胞的空泡發(fā)生率，以及觀察腋窩部皮膚汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑大小等。著色法雖簡單易行，但靈敏度不高，易受外界因素影響，而出現(xiàn)假陽性。定量測量法對稱量的準(zhǔn)確性有很高要求，此實驗難于在同一時間段內(nèi)完成。由于皮膚的電阻變化很大，導(dǎo)致皮膚電生理方法誤差較大。皮毛觀察法方法簡單，但容易摻雜主觀判斷的誤差。觀察汗腺上皮細(xì)胞的空泡化現(xiàn)象，容易受切片位置、視野等因素的影響。觀察腋窩部皮膚汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑大小的方法，受外界影響因素少，結(jié)果可靠，可為研究中藥發(fā)汁作用提供科學(xué)、準(zhǔn)確、可行的實驗方法。因此本實驗選擇通過測量汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑評價麻黃湯及其配伍的發(fā)汗作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，每個飲片組及顆粒組的小鼠汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑較空白組都有增大，且與空白組比較兩者都具有顯著性差異（P＜0.01），說明所有配伍組都有較強(qiáng)的發(fā)汗藥效作用。麻黃湯全方組小鼠汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑都比其他8個配伍組都大（P＜0.01），全方的發(fā)汗作用最強(qiáng)，可見麻黃湯四味組方藥味配伍合用蘊(yùn)含著深奧的組方原理。而麻黃湯全方飲片組比其顆粒組小鼠汗腺導(dǎo)管內(nèi)徑大（P＜0.05），顆粒組有更強(qiáng)的藥效作用，可見麻黃湯全方的發(fā)汗作用與它的制備方法相關(guān)。中藥復(fù)方在混合共煎中，受容器、加水量、煎煮火力、煎煮時間、溶劑pH值等多種因素的影響，各成分之間發(fā)生了極為復(fù)雜的物理或化學(xué)的反應(yīng)，從而使有效成分的溶出效果增加或者減少。中藥配方顆粒劑是將單味中藥“分煎”后合并，缺少藥物共煎環(huán)節(jié)，因此導(dǎo)致某些復(fù)方的配方顆粒使用效果不佳。

根據(jù)實驗結(jié)果可知：①不論是飲片組還是顆粒組，含麻黃的各配伍組的小鼠汗腺高管內(nèi)徑都比不含麻黃的各配伍組大，如麻桂杏組＞桂杏組（P＜0.001），麻桂甘組＞桂甘組（P＜0.01），麻黃湯組＞桂杏甘組（P＜0.001），由此可見，麻黃對小鼠發(fā)汗作用有很大的影響。②麻杏甘組＞桂杏甘組（P＜0.01），麻杏組＞桂杏組（P＜0.01），麻甘組＞桂甘組（P＜0.01），可見麻黃比桂枝有更強(qiáng)的發(fā)汗作用，實驗結(jié)果與麻黃湯中麻黃是“君藥”相符合。③麻桂杏組＞桂杏組（P＜0.001），麻桂杏組＞麻杏組（P＜0.05），可見麻黃與桂枝配伍，其發(fā)汗作用增強(qiáng)，此結(jié)果與其他文獻(xiàn)研究結(jié)果相吻合[4-6]，符合麻黃桂枝相須配方的組方規(guī)律。另外，由于條件限制，實驗組數(shù)量不夠，要更進(jìn)一步闡明麻黃湯組方配伍原理，需增設(shè)多組動物實驗，如單味藥組。

綜上所述，麻黃湯及其拆方配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑對小鼠都有明顯的發(fā)汗作用，但麻黃湯全方傳統(tǒng)飲片組優(yōu)于配方顆粒組，麻黃湯中藥配方顆粒完全替代傳統(tǒng)飲片在臨床推廣使用仍有待商榷。