程興 潘小玲 楊雯 胡傳琛 陸海鵬 王建偉 應(yīng)鳴翹 傅亞明 邵慧軍 陳紅芳

缺血性腦卒中易導致患者殘疾甚至死亡，其中由于頸動脈粥樣硬化斑塊破裂、脫落所致的缺血性腦卒中約占20%。然而，目前臨床上缺乏可以有效評估斑塊穩(wěn)定性以便篩選缺血性腦卒中高危人群的生物標志物。miRNAs是真核生物體內(nèi)能夠可逆性調(diào)控基因表達的一類非編碼RNA，參與幾乎所有人體生命活動的主要進程，包括細胞增殖、分化和凋亡等[1]。本研究選取5種可能與動脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的miRNAs，即miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222，比較其在不同類型頸動脈粥樣硬化斑塊患者中的表達水平，并探討這些指標評估斑塊穩(wěn)定性的臨床意義，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年9月至2017年3月我院神經(jīng)內(nèi)科就診的腦梗死組患者35例（腦梗死組），其中男24 例，女 11 例，年齡 50～84（69.3±10.6）歲；同期體檢中心經(jīng)多普勒彩超證實存在頸動脈不穩(wěn)定斑塊患者41例（不穩(wěn)定斑塊組），男 24例，女17例，年齡 45～90（66.0±11.2）歲；穩(wěn)定斑塊患者 28例（穩(wěn)定斑塊組），男16 例，女 12 例，年齡 58～82（68.3±5.8）歲；另選健康體檢者30例作為健康對照組，其中男16例，女14例，年齡54～78（66.7±7.2）歲。腦梗死組患者診斷均符合2014年中國急性缺血性腦卒中診治指南標準，經(jīng)頭顱MRI檢查證實為頸內(nèi)動脈系統(tǒng)的腦梗死，且經(jīng)多普勒彩超證實合并存在頸動脈不穩(wěn)定斑塊。所有受試者均排除急慢性炎癥、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病，并均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料比較 記錄并比較4組對象吸煙、飲酒情況及高血壓、糖尿病、冠心病、房顫患病率，記錄并比較各組血脂 4項水平（LDL－C、HDL－C、TG、TC）。

1.2.2 實時定量熒光PCR（RT－qPCR）檢測 引物設(shè)計及合成委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進行，各基因的引物序列見表1。以Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、氯仿提取血漿總RNA，異丙醇沉淀回收RNA，75%乙醇洗滌RNA沉淀，焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶解，得到RNA溶液。利用提取的總RNA，加入特異性引物，用DEPC 水定容至 12μl，70℃溫浴 5min，迅速置冰上 10s。離心，加入 4μl反應(yīng)緩沖液、2μl dNTP、1μl RNA 酶抑制劑、1μl RevertAidTMM－MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（加拿大 Fermentas公司），37℃溫浴 5min，42℃溫浴 1h，70℃溫浴10min后終止反應(yīng)。Q－PCR利用SYBR GreenⅠ PCR試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）完成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10min；然后進入 95℃ 15s，60℃ 1min的循環(huán)（共40次），每個反應(yīng)有3次重復。以5S rRNA作為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCt方法計算相對表達量，各組相比健康對照組的表達倍數(shù)差異采用log2轉(zhuǎn)換。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；健康對照組與腦梗死組中miRNAs和血脂水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RT-qPCR反應(yīng)引物序列

2 結(jié)果

2.1 4組對象的一般資料比較 見表2。

表2 4組對象的一般資料比較

由表2可見，4組對象吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、冠心病、房顫患病率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組的TC水平明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。腦梗死組的HDL-C水平明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 4 組對象的 miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222表達水平比較 見表3。

表 3 4 組對象的 miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222 表達水平比較

由表3可見，腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組的 miR-21、miR-155、miR-221、miR-222 表達水平均明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。不穩(wěn)定斑塊組的miR-126表達水平低于穩(wěn)定斑塊組，腦梗死組的miR-126表達水平低于不穩(wěn)定斑塊組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

2.3 miRNAs表達水平與血脂4項水平的相關(guān)性 見表4。

表4 miRNAs表達水平與血脂4項水平的相關(guān)性

由表4可見，腦梗死組的miR-126表達水平與LDL-C、TC 水平呈負相關(guān)，而 miR-21、miR-155、miR-221、miR-222與血脂水平無明顯相關(guān)性。

3 討論

動脈粥樣硬化是累及中等或大血管的慢性血管炎癥性疾病，目前認為其病理機制涉及血管內(nèi)皮功能的失調(diào)引起管壁粥樣硬化斑塊的沉積，進一步發(fā)展導致血管的缺血、閉塞。miRNAs可通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的功能，參與血管平滑肌細胞從非增殖狀態(tài)到增殖狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，與動脈粥樣硬化形成密切相關(guān)。本研究選取迄今為止文獻報道在人體或動物實驗中發(fā)現(xiàn)可能與動脈粥樣硬化相關(guān)的其中5種miRNAs，即miR-21、miR-126、miR-155、miR-221、miR-222，進一步探究其在不同類型頸動脈粥樣硬化斑塊的表達差異。

通過比較5種miRNAs在腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組及健康對照組血漿中的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)的確存在miRNAs表達水平的明顯變化。其中，miR-21、miR-155、miR-221、miR-222 在腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組患者中均明顯升高，提示其可能起到促進動脈粥樣硬化形成的作用。有研究表明，動脈血管中miR-21的異常過表達易導致新生血管內(nèi)膜損傷從而增加心血管事件風險[2-3]。Raitoharju等[4]發(fā)現(xiàn)miR-21在頸動脈粥樣硬化患者中的表達水平顯著上升，與我們的研究結(jié)果相一致。miR-155與內(nèi)皮細胞炎癥應(yīng)答及機體免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)，通過調(diào)控內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶而影響血管內(nèi)皮的舒張，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[5]。在動脈粥樣硬化小鼠的外周血和巨噬細胞中，miR-155的表達水平明顯升高，敲除或抑制miR-155可明顯縮小斑塊的大小及抑制巨噬細胞的積聚[6-7]。而miR-221、miR-222的生物學功能則被認為具有細胞特異性：在血管平滑肌細胞中，miR-221、miR-222具有促進細胞增殖、遷移、凋亡的作用，而在血管內(nèi)皮細胞中其作用則恰好相反[8]。本研究值得關(guān)注的另一個發(fā)現(xiàn)，miR-126在腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組之間存在顯著梯度性的下降。miR-126在血管內(nèi)皮細胞中高度表達，與血管重塑密切相關(guān)，可調(diào)控血管細胞黏附分子1、單核細胞趨化蛋白等相關(guān)靶基因的表達[9]。目前研究認為，miR-126的表達升高可起到抗動脈粥樣硬化作用。在大鼠線栓法大腦中動脈閉塞模型中，血清miR-126的表達水平被檢測到明顯的降低[10]。目前認為，斑塊的穩(wěn)定性主要與其內(nèi)部脂質(zhì)含量相關(guān)，其中主要指的是氧化LDL-C[11]。另外，我們在腦梗死組與健康對照組比較中發(fā)現(xiàn)，miR-126的表達水平與LDL-C、TC水平呈明顯負相關(guān)。因而，本研究首次揭示miR-126可能與頸動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展、演變密切相關(guān)，并且有望成為預(yù)測腦卒中風險評估的生物標志物。

本研究測定了與動脈粥樣硬化斑塊形成、演變密切相關(guān)的5種miRNAs在不同類型頸動脈粥樣硬化斑塊，即腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組及健康對照血漿中的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-155、miR-221、miR-222在腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組中均明顯升高，提示可能起著促進動脈粥樣硬化形成的作用。而miR-126在腦梗死組、不穩(wěn)定斑塊組、穩(wěn)定斑塊組之間存在顯著梯度性的下降，揭示miR-126可能與頸動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展、演變落密切相關(guān)，并且有望成為預(yù)測腦卒中風險評估的生物標志物，值得后續(xù)更大樣本或多中心的病例對照研究進行進一步的論證。