姚濤 王翠芳 張琦 徐露 崔琴 彭勃 高巖 李剛

動脈硬化程度是腦卒中、急性心肌梗死、心力衰竭等心血管事件的危險因素[1-2]，能夠預測正常人群和慢性腎病患者心血管病死亡率及全因死亡率[3-4]。臨床用于評估動脈硬化的方法有多種，頸-股動脈脈搏波傳導速度（carotid-femoral pulse wave velocity,cfPWV）是用作衡量動脈硬化水平的重要指標[5-8]。除高血壓、吸煙、高脂血癥、糖尿病等常見心腦血管疾病危險因素能導致動脈硬化外，研究發(fā)現(xiàn)炎癥及免疫機制在動脈硬化的進展中也具有重要的作用[9-11]。血管緊張素Ⅱ1型受體自體抗體（autoantibodies againstangiotensinⅡ type 1 receptor,AT1-AAs）和α1-腎上腺素受體自體抗體（au－toantibodies against alpha1-adrenergic receptor，α1-AAs）作為自身免疫反應的產物，能夠導致血管損傷和心室重構[12-13]，與高血壓病發(fā)病密切相關[14]。在血壓正常者中，AT1-AAs和α1-AAs能否通過相關機制致使血管重構、動脈硬化，從而導致發(fā)生高血壓，目前還沒有較多研究。因此，本研究對血壓正常人群進行AT1-AAs和α1-AAs水平檢測并進行5年時間的隨訪，探討AT1-AAs和α1-AAs這兩種自體抗體與動脈硬化進展的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 根據世界衛(wèi)生組織的指南，選擇2010年9月至2011年3月于湖北省中醫(yī)院進行健康體檢者1 148例，納入標準：（1）正常血壓（收縮壓＜140mmHg和舒張壓＜90mmHg）；（2）18 周歲以上。排除標準：（1）患有心力衰竭、心肌病、冠心病以及其他器質性心臟病者；（2）患腦血管病、外周動脈疾病、糖尿病者。在2010年12月至2016年4月期間，電話隨訪每3個月1次，門診隨訪每年1次，失訪332例，完成5年隨訪816例（71.1%），男476例，女340例，年齡（39.1±7.8）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 一般指標收集 記錄研究對象的年齡、性別、既往史、吸煙、收縮壓、舒張壓、身高、體重等臨床資料，并計算 BMI；記錄研究對象空腹 TG、TC、LDL-C、HDL-C、空腹血糖、血肌酐（Cr）等生化指標。記錄隨訪過程中確診高血壓者高血壓的發(fā)病時間（入組時至隨訪中確診高血壓的時間）。

1.2.2 cfPWV檢測 采用澳大利亞AtCor Medical的SphygmoCor儀于上午 8：00～10：00，室溫控制在 22～25℃時測量研究對象的cfPWV。受試者在檢測室內安靜休息 5min后取仰臥位連接心電圖，將壓力記錄探頭放置于其右頸動脈及股動脈體表采樣點。使用皮尺測量頸動脈至股動脈體表采樣點之間的距離，記錄心電圖波形校正的頸動脈及股動脈波形并計算兩者之間的時間差，連續(xù)記錄10次兩種波形時間差并計算平均值。cfPWV（m/s）=兩個采樣點之間的距離間的距離（m）/兩個波形時間差平均值（s）。對每位受試者重復測量3次，每次間隔5 min，取 3次的平均值為最后結果。入組時和5年后隨訪時各檢測1次，兩次cfPWV結果分別記錄為基線cfPWV和隨訪cfPWV。定義 ΔcfPWV（m/s）=隨訪 cfPWV-基線 cfPWV（m/s），年平均 ΔcfPWV=ΔcfPWV/5（m/s）；將研究對象基線 cfPWV≤10m/s且隨訪時cfPWV＞12m/s定義為動脈硬化進展。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用方差分析；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。變量之間的相關性分析采用Pearson相關系數，將性別及單因素分析P＜0.1的變量納入多因素線性回歸分析；采用Cox回歸模型分析AT1-AAs和α1-AAs不同表達類型者動脈硬化進展及高血壓患病風險。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AT1-AAs和α1-AAs水平檢測 結果與分組根據研究對象的兩種抗體水平將其分為 4 組：AT1（-）、α1（-）為 A 組；AT1（+）、α1（-）為 B 組；AT1（-）、α1（+）為 C組；AT1（+）、α1（+）為 D 組，分別為 521、132、97、66 例。

2.2 研究對象一般資料 入組的816例研究對象基線收縮壓為（125.9±9.4）mmHg，舒張壓（75.2±7.1）mmHg,脈壓差（50.7±9.5）mmHg，平均動脈壓（92.1±6.5）mmHg；基線cfPWV為（9.90±0.84）m/s，5年后隨訪時 cfPWV 為（10.51±1.12）m/s。年平均 cfPWV 變化值（ΔcfPWV）為（0.12±0.08）m·s-1·y-1。隨訪結束時，研究對象確診高血壓129例，出現(xiàn)動脈硬化進展144例。不同自體抗體表達類型4組基線資料比較見表1。

由表1可見，A組的年齡、BMI、心率低于其它3

1.2.3 檢測AT1-AAs和α1-AAs表達 采用Zhao等[15]在研究中的使用的方法合成多肽以及檢測血清AT1-AAs和α1-AAs表達。首先，使用日本島津公司的PSSM-8型多肽自動合成儀合成具有抗原決定簇的AT1-受體和α1-受體細胞外第二環(huán)多肽片段；再將AT1-受體和α1-受體多肽片段溶解于0.1mmol/L的碳酸緩沖液中（pH=9.6），配成 100μg/ml和 50μg/ml的抗原包被液，以每100μl的量包被反應孔，4℃冰箱過夜。加1%FBS白蛋白并PBS封閉，37℃溫浴2h，用PBS緩沖液洗滌3次，加入稀釋血清，37℃溫浴2h，PBS洗滌 3次，加入 1∶2 000辣根過氧化物酶酶標抗體（珠海海泰公司），37℃溫浴 1h，再加入雙氧水和 TMB溫浴放置，充分顯色后加入2mol/L硫酸終止反應,在酶標儀上以450nm波長測定光密度（A值）。實驗中設置空白對照和陽性、陰性對照，測 A值時以空白對照凋零，以保證檢測結果可靠性。以健康人群為參考血清，取A值超出對照健康人群2倍標準差的患者血清標本作為陽性對照血清。研究血清與陰性血清的吸光度之比[（標本A值-空白對照A值）/（陰性對照A值-空白對照A值）] ＞2.1倍者判為抗體檢測陽性。個組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而4組間性別、吸煙、空腹血糖、收縮壓、舒張壓、脈壓差、平均動脈壓、TC、TG、LDL-C、HDL-C 及 Cr比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 不同自體抗體表達類型4組動脈硬化進展及高血壓患病情況的比較 見表2。

表1 不同自體抗體表達類型4組基線資料比較

表2 不同自體抗體表達類型4組動脈硬化進展及高血壓患病情況的比較

由表 2可見，B、C、D 組 ΔcfPWV、年平均 ΔcfPWV均短于A組，而高血壓的發(fā)病時間小于A組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。D組的動脈硬化進展以及高血壓患病比率顯著高于其它3組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.4 基線指標與動脈硬化進展的關系 分析144例出現(xiàn)動脈硬化進展者的基線指標，它們與動脈硬化進展的關系見表3。

表3 基線指標與動脈硬化進展的關系

由表3可見，單因素相關分析結果顯示，年齡、BMI、收縮壓、心率、基線自體抗體類型以及基線cfPWV與動脈硬化進展相關（均P＜0.05）。

2.5 基線自體抗體與ΔcfPWV、年平均ΔcfPWV的關系 在調整年齡、性別、BMI、收縮壓、平均動脈壓、心率、基線cfPWV、TC、吸煙因素后，多因素線性回歸分析結果顯示，基線自體抗體是影響ΔcfPWV和年平均ΔcfPWV的獨立危險因素，見表4。

表4 基線自體抗體與ΔcfPWV、年平均ΔcfPWV的關系

2.6 不同自體抗體表達類型與動脈硬化進展和高血壓患病的關系 見表5。

表5 不同自體抗體表達類型與動脈硬化進展和高血壓患病的關系

由表5可見，在調整年齡、性別、BMI、收縮壓、平均動脈壓、心率和基線cfPWV因素后，Cox回歸模型分析結果顯示，D組動脈硬化進展和高血壓患病風險明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

本研究對816例血壓正常研究對象進行平均5年的隨訪，研究發(fā)現(xiàn)AT1-AAs和α1-AAs是動脈硬化進展獨立的危險因素。不同類型的抗體陽性其動脈硬化進展的程度也不相同，在調整自變量影響后，AT1-AAs和α1-AAs均為陽性者其動脈硬化的進展程度要顯著的高于單一抗體陽性或兩個抗體均為陽性者。AT1-AAs和α1-AAs陽性者原發(fā)性高血壓的患病風險要顯著的高于抗體陰性者。

國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，免疫及炎癥在心血管疾病發(fā)病機制中具有重要的作用。

Schiffrind 等[16]、Caillon 等[17]研究表明，免疫炎癥機制參與了動脈硬化及高血壓的病理進程。自1999年Wallukat等[18]首次在先兆子癇患者的血清中發(fā)現(xiàn)了AT1-AAs以來，該自體抗體被證實存在于高血壓、動脈硬化、心力衰竭等多種心血管疾病患者的血清中，隨后對AT1-AAs的心血管效應、作用機制和臨床意義的研究已引起了廣泛關注。2004年Wallukat等[18]研究發(fā)現(xiàn)該自體抗體能增加乳鼠心肌細胞的收縮能力和頻率，發(fā)揮著與AngⅡ類似的激動劑效應。在我們的研究人群中，AT1-AAs陽性患者的心率較陰性患者顯著增加。此外，AngⅡ可作用于血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的 AT1R，促進內層平滑肌細胞增殖，并遷移至血管內膜，導致血管壁增厚，管腔狹窄，從而引起血管重塑[19]。AT1-AAs在各級血管中也具有激動劑樣效應。Jin等[20]采用主動免疫法建立AT1R-AA陽性大鼠模型，結果顯示實驗組大鼠的主動脈內膜出現(xiàn)不同程度的增厚，內膜VSMC排列失序，VSMC的增殖使得外周血管發(fā)生結構和功能重塑，進而導致動脈硬化的發(fā)生。Li等[21]也發(fā)現(xiàn)AT1-AAs通過作用于內皮細胞的AT1受體，通過炎癥及免疫調節(jié)導致內皮細胞功能障礙、單核細胞集聚以及炎癥增生，從而參與動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。大量研究的結果顯示，AT1-AAs與血管內皮細胞損傷和功能障礙密切相關，我們推測這可能是AT1-AAs參與動脈硬化以及心血管疾病的機制之一。α1-AAs為IgM或IgG型免疫球蛋白，具有去甲腎上腺素樣作用。Zhou等[22]研究發(fā)現(xiàn)α1-AAs可通過上調c-jun的表達，刺激VSMC的增殖、心肌細胞的搏動頻率，導致心臟和血管重塑。Yan等[23]通過對大鼠模型8個月的觀察研究，發(fā)現(xiàn)大鼠血管內長時間存在α1-AAs的可以導致血管內皮功能減退，通過巨噬細胞增生后逐步引起血管損傷及內皮增生。我們推測α1-AAs引起VSMC的增殖和血管內皮細胞的損傷增生，是導致動脈硬化的病理基礎。本研究中，α1-AAs陽性者的心率較抗體陰性者差異無統(tǒng)計學意義，但動脈硬化進展和高血壓的發(fā)病率則顯著的增加。免疫和炎癥機制也參與了高血壓的發(fā)病過程[16，23]，其中AT1-AAs和α1-AAs通過刺激血管收縮、調節(jié)鈣離子通道以及血管炎癥反應從而影響正常血壓[24-25]。Lei等[26]最新的一項薈萃分析結果顯示，AT1-AAs與高血壓病尤其是先兆子癇密切相關，并可以用于預測先兆子癇患者的預后結局。我們首次在大規(guī)模的血壓正常人群中對這兩種抗體進行了檢測，雖然AT1-AAs和α1-AAs抗體同時存在人群較少（8.1%），但他們的動脈硬化進展和高血壓發(fā)病率均顯著的高于單抗陽性或雙抗體陰性人群。我們推測AT1-AAs和α1-AAs分別模擬了AngⅡ和去甲腎上腺素激動樣作用，因此導致兩個抗體均為陽性人群的RAAS和交感系統(tǒng)被同時激活，最終造成了這部分人群心率顯著增加、血管重塑加劇以及心室重構，最終導致動脈硬化和高血壓顯著進展。

本研究結果表明，AT1-AAs和α1-AAs這兩種自體抗體是血壓正常人群動脈硬化進展的獨立危險因素。在AT1-AAs和α1-AAs均為陽性的研究對象中，原發(fā)性高血壓發(fā)病率及動脈硬化進展明顯增加。這兩種抗體來有可能作為動脈硬化和高血壓的治療靶點，有待進一步的研究。