吳永祥 王雅群 戴 毅 金泰完 周 訊 陳向陽,*

(1 黃山學院生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041；2 安東國立大學食品科學與生物技術(shù)學院，韓國 慶尚北道 安東 760749；3 黃山學院分析測試中心，安徽 黃山 245041)

白術(shù)為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，為我國傳統(tǒng)常用中藥材之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。祁白術(shù)，因僅野生分布于安徽祁門地區(qū)而得名，為安徽著名道地藥材。研究表明，祁白術(shù)在cpDNA和核基因水平等遺傳信息及化學成分上，都展現(xiàn)出特殊的群體結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出與栽培白術(shù)不同的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3]。祁白術(shù)的主要生物活性成分為多酚[4]、內(nèi)酯類物質(zhì)[5]、多糖[6]等，具有抑菌[4]、降血糖及降血脂[7]等功效。吳永祥等[4]揭示了多酚類物質(zhì)是祁白術(shù)中一種非常重要的次生代謝產(chǎn)物，是祁白術(shù)的主要活性成分之一，是其發(fā)揮抗氧化、抑菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

多酚提取的主要方法包括有機溶劑萃取法、超聲波提取法、高剪切分散乳化法、微波提取法等，但存在耗時太長、提取工藝不完善、易混入雜質(zhì)、儀器設(shè)備成本高、不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等問題[8-9]。而酶法作為提取生物活性成分的一種新興生物技術(shù)，能夠破壞以纖維素為主的細胞壁結(jié)構(gòu)，使得細胞內(nèi)生物活性物質(zhì)被充分釋放，并具有耗時短、反應溫和、對設(shè)備和工藝的要求較少、對多酚類物質(zhì)破壞小等優(yōu)點[10]。唐霄等[8]研究發(fā)現(xiàn)，酶法可提高菠蘿皮多酚的提取率，較乙醇回流提取法和超聲波提取法分別高2.45%和1.86%；王華斌等[11]利用酶法對石榴皮多酚提取工藝進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取率比傳統(tǒng)溶劑浸提法高出16.84%；李萌萌等[12]利用纖維素酶輔助提取紅樹莓籽黃酮，提取率有較大提高。目前，酶法在祁白術(shù)多酚提取中的應用尚未見報道，仍然缺乏祁白術(shù)多酚(polyphenols fromAtractylodesmacrocephalaKoidz grown in Qimen，AMP)的抗氧化及對α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte- stimulating hormone，α-MSH)誘導的B16細胞內(nèi)黑色素生成抑制作用的研究。

本試驗應用酶法提取祁白術(shù)中多酚類物質(zhì)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計方法對AMP提取量的二次回歸模型進行分析，確定AMP的最佳提取工藝，探討AMP的抗氧化、對B16細胞活力、細胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響，以期為祁白術(shù)多酚的高值化開發(fā)應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

祁白術(shù)，2017年8月于安徽省祁門縣古溪鄉(xiāng)采集；小鼠B16細胞，美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)；Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)液、胎牛血清及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)粉劑等細胞培養(yǎng)試劑，美國Gibco公司；纖維素酶(40 000 U·g-1)，上海如吉生物科技有限公司；福林酚試劑、丹寧酸(tannic acid，TA)、維生素C(Vc)、熊果苷(純度98%，Arbutin)、左旋多巴、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)等，美國Sigma公司。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計與因素水平表Table 1 Design and factors of Box-Behnken experimental

1.2 主要儀器與設(shè)備

FE28-standard型精密pH計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；SpectraMax-190型全波長酶標儀，美國Molecular Devices公司；WJ-80A-Ⅱ型CO2培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造公司；ZHJH-C2109B型超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；WH220- PLUS型磁力攪拌器，北京桑翌實驗儀器研究所；IX51型倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 AMP的提取及含量測定 將干燥后的祁白術(shù)粉碎成粉末，過80目篩。取祁白術(shù)粉末3.0 g，按照料液比1∶25 g·mL-1加入1%的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH值至4.5，在溫度40℃條件下，以600 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌，酶解15 min。抽濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥，得到祁白術(shù)多酚提取物的粉末。采用福林酚法測定AMP的含量。繪制單寧酸標準曲線，以吸光值(Y)為縱坐標，單寧酸濃度(X)為橫坐標，得到回歸方程為：Y=0.001 4X+0.005 3(R2=0.996)。根據(jù)單寧酸標準曲線計算AMP含量，結(jié)果以每克祁白術(shù)多酚提取物中含有相當單寧酸毫克數(shù)表示，即 mg TA·g-1。

1.3.2 單因素試驗 各因素的試驗梯度分別為：纖維素酶添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；酶解溫度分別為30、40、50、60、70℃；酶解時間分別為5、10、15、20、30 min；pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；攪拌轉(zhuǎn)速分別為300、450、600、750、900 r·min-1；料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g·mL-1。在進行單因素試驗時，除自身因素變化外，其他因素水平不變，每個試驗重復3次。

1.3.3 響應面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以纖維素酶添加量(A)、酶解溫度(B)、pH值(C)、攪拌轉(zhuǎn)速(D)為考察因素，應用響應面法中的Box-Behnken中心組合設(shè)計四因素三水平的響應面試驗，進一步優(yōu)化提取條件。試驗設(shè)計與因素水平見表1。

1.3.4 AMP抗氧化活性的測定

1.3.4.1 總還原力的測定 參考文獻[13-14]的測定方法并略作修改。在100 μL不同濃度的AMP(0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1)中加入pH值6.6磷酸緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各100 μL，混勻后在50℃水浴鍋反應20 min，冷卻后加入100 μL 10%三氯乙酸，混勻后3 000 r·min-1離心15 min；取上清液90 μL，加入100 μL蒸餾水和10 μL 0.1%三氯化鐵，反應10 min后利用酶標儀在700 nm波長處測定吸光度值。以Vc為陽性對照。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的測定 參考孫朦等[15]的測定方法并略作修改。取50 μL 0.2 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液，分別加入100 μL不同濃度的AMP(0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1)，混勻后避光室溫反應10 min，于517 nm波長處測定樣品組吸光度值。以Vc為陽性對照，并按照公式計算DPPH自由基清除率：

(1)

式中，Ⅰ表示DPPH自由基清除率；AS為樣品組吸光度值；ASB為100 μL AMP與50 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度值；AC為100 μL蒸餾水與50 μL DPPH溶液的吸光度值；ACB為100 μL 蒸餾水與50 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度值。

1.3.4.3 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻[16-17]的測定方法并略作修改。取等體積的 7 mmol·L-1ABTS溶液和2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液，混勻后室溫避光反應16 h，得ABTS陽離子溶液。取100 μL ABTS陽離子溶液，分別加入50 μL不同濃度的AMP(0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1)，混勻后避光室溫反應5 min，于734 nm波長處測定樣品組吸光度值。以Vc為陽性對照，并按照公式計算ABTS自由基清除率：

(2)

式中，Ⅰ表示ABTS自由基清除率；AS為樣品組吸光度值；ASB為50 μL AMP與100 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度值；AC為50 μL蒸餾水與100 μL ABTS溶液的吸光度值；ACB為50 μL蒸餾水與100 μL 99.9%乙醇溶液的吸光度值。

1.3.5 AMP對B16細胞的影響

1.3.5.1 B16細胞培養(yǎng)及黑色素高表達細胞模型的建立 小鼠B16細胞置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2且相對飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的B16細胞，以5×104個·mL-1接種于12孔板中，每孔1 mL，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入0.2 μmol·L-1α-MSH進行誘導(除空白對照組)，構(gòu)建α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型。

1.3.5.2 試驗分組設(shè)計 將B16細胞設(shè)置為空白對照組、α-MSH模型組、AMP組(α-MSH誘導+AMP處理)、陽性對照組(α-MSH誘導+Arbutin處理)，各組均設(shè)3個復孔。AMP處理濃度分別為0.002 5、0.005、0.01、0.02 mg·mL-1。

1.3.5.3 細胞活力的測定 取B16細胞以1×105個·mL-1接種于96孔板中，每孔0.1 mL。貼壁培養(yǎng)24 h后，按照試驗分組加入濃度梯度為0.002 5、0.005、0.01、0.02 mg·mL-1的AMP。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，3 h后除去孔內(nèi)液體，每孔加入200 μL二甲基亞砜，震蕩均勻，于570 nm波長處測定各孔吸光度值[18]。按照公式計算細胞相對活力：

(3)

式中，Ⅰ 表示細胞的相對活力；AS為樣品組吸光值；AC為空白對照組的吸光值。

1.3.5.4 細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測定 取B16細胞以1×105個·mL-1接種于12孔板中，每孔1 mL。貼壁培養(yǎng)24 h后，按照試驗分組加入0.2 μmol·L-1α-MSH進行誘導，并加入濃度梯度為0.002 5、0.005、0.01、0.02 mg·mL-1的AMP，以及0.1 mg·mL-1的陽性對照Arbutin。培養(yǎng)48 h后，采用L-Dopa氧化法測定細胞內(nèi)酪氨酸酶活性[19-20]。細胞溶液中蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford法。按照公式計算細胞內(nèi)酪氨酸酶的相對活性：

(4)

式中，Ⅰ 表示細胞內(nèi)酪氨酸酶的相對活性；TS為樣品組中每毫克蛋白質(zhì)中的酪氨酸酶活性；TC為α-MSH模型組中每毫克蛋白質(zhì)中的酪氨酸酶活性。

1.3.5.5 細胞內(nèi)黑色素含量的測定 細胞處理同1.3.5.4，采用NaOH裂解法測定細胞內(nèi)黑色素的含量[21]。繪制黑色素標準曲線，以吸光值(Y)為縱坐標，黑色素濃度(X)為橫坐標，得到回歸方程為：Y=0.009X+0.000 08(R2=0.992)。根據(jù)黑色素標準曲線計算細胞內(nèi)黑色素的含量。細胞溶液中蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford法。按照公式計算細胞內(nèi)黑色素的相對含量：

(5)

式中，Ⅰ 表示細胞內(nèi)黑色素的相對含量；MS為樣品組中每毫克蛋白質(zhì)中的黑色素含量；MC為α-MSH模型組中每毫克蛋白質(zhì)中的黑色素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對AMP提取量的影響 由圖1可知，AMP提取量隨著纖維素酶添加量的增加呈先增加后減少的趨勢。當纖維素酶添加量為1.0%時，AMP提取量達到最大值，為22.59±0.67 mg·g-1，而未添加纖維素酶時，AMP提取量僅為15.85±0.19 mg·g-1，多酚提取率提高了42.52%，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。纖維素酶的添加能有效破壞細胞壁，有助于祁白術(shù)中多酚類物質(zhì)的溶出，但隨著添加量的增加，酶解的同時一部分纖維附在顆粒表面，阻礙多酚的部分溶出通道，從而降低AMP的提取量[22]。因此，選取纖維素酶添加量0.5%～1.5%作為響應面試驗考察條件。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 纖維素酶添加量對AMP提取量的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction amount of AMP

2.1.2 酶解溫度對AMP提取量的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，AMP提取量快速增加，當溫度為50℃時，多酚提取量達到最大，為22.22±0.31 mg·g-1，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；當酶解溫度繼續(xù)升高，AMP提取量反而下降。表明酶解溫度為50℃時，纖維素酶穩(wěn)定性最好、活性最大，但當酶解溫度過高，會使酶蛋白發(fā)生變性、穩(wěn)定性下降，導致多酚提取量的降低[12]。因此，選取酶解溫度40～60℃作為響應面試驗考察條件。

圖2 酶解溫度對AMP提取量的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on the extraction amount of AMP

2.1.3 酶解時間對AMP提取量的影響 由圖3可知，隨著酶解時間的延長，AMP提取量逐漸增加，當酶解時間為20 min時，多酚提取量達到最大，為22.76±0.63 mg·g-1。繼續(xù)延長酶解時間，AMP提取量變化不明顯。表明在20 min時，酶解基本完全，繼續(xù)增加酶解時間對提高多酚的提取量幾乎無影響。因此，選取酶解時間20 min作為后續(xù)試驗，但不作為響應面試驗考察條件。

圖3 酶解時間對AMP提取量的影響Fig.3 Effect of enzymatic time on the extraction amount of AMP

2.1.4 pH值對AMP提取量的影響 由圖4可知，pH值在3.5～4.5范圍時，AMP提取量隨著pH值的增大而增加，當pH值為4.5時，AMP提取量達到最大，為22.30±0.37 mg·g-1，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。繼續(xù)增大pH值，多酚提取量呈下降趨勢。表明纖維素酶在pH值為4.5時，酶活力最強，過低或過高pH會破壞酶空間結(jié)構(gòu)的共價鍵，導致酶變性，提取量降低。因此，選取pH 值4.0～5.0 作為響應面試驗考察條件。

圖4 pH值對AMP提取量的影響Fig.4 Effect of pH value on the extraction amount of AMP

2.1.5 攪拌轉(zhuǎn)速對AMP提取量的影響 由圖5可知，攪拌轉(zhuǎn)速在300～600 r·min-1時，隨著轉(zhuǎn)速的不斷增加，AMP提取量持續(xù)增加，在轉(zhuǎn)速為600 r·min-1時，AMP提取量達到最大，為22.91±0.19 mg·g-1，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，繼續(xù)增大攪拌轉(zhuǎn)速，多酚提取量逐漸下降。表明攪拌可以促進酶與底物的反應，利于祁白術(shù)中多酚物質(zhì)的溶出，但攪拌轉(zhuǎn)速過大可能會導致某些多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，提取量下降[23]。因此，選取轉(zhuǎn)速450～750 r·min-1作為響應面試驗考察條件。

圖5 攪拌轉(zhuǎn)速對AMP提取量的影響Fig.5 Effect of rotation speed on the extraction amount of AMP

2.1.6 料液比對AMP提取量的影響 由圖6可知，隨著料液比的增大，AMP提取量逐漸增加，當料液比達到1∶30 g·mL-1時，多酚提取達到最大，為22.66±0.66 mg·g-1，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，繼續(xù)增加料液比，AMP提取量變化不明顯。表明料液比在1∶30 g·mL-1時，纖維素酶與底物完全反應，因而得到最大值。因此，選取料液比1∶30 g·mL-1作為后續(xù)試驗條件，但不作為響應面試驗考察條件。

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立 響應面分析方案與結(jié)果見表2。利用Design-Expert Ⅴ 8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析，得到編碼回歸方程為：

AMP提取量(Y)=25.65+0.77A-1.38B+1.27C+1.77D-1.01AB+0.83AC-0.077AD-0.19BC-0.19BD-0.078CD-1.19A2-1.99B2-2.32C2-1.92D2。

表2 酶法提取AMP的響應面試驗結(jié)果Table 2 The results of enzymatic extraction of AMP by response surface methodology

圖6 料液比對AMP提取量的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ration on the extraction amount of AMP

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) regression model

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:*indicates significant difference at 0.05 level.**indicates extremely significant difference at 0.01 level.

一次項酶解溫度(B)、pH值(C)、攪拌轉(zhuǎn)速(D)對AMP提取量的影響均達到了極顯著水平(P<0.000 1)，一次項纖維素酶添加量(A)達到了顯著水平(P<0.05)；二次項A2、B2、C2、D2均達到了極顯著水平(P<0.000 1)；交互項AB、AC對AMP提取量也達到了顯著水平(P<0.05)，其他因素之間的影響不顯著。對表3中數(shù)據(jù)進行響應面曲線分析，二者呈較好的二次拋物線關(guān)系，AMP提取量存在最大值。

2.2.3 驗證試驗 利用Design-Expert Ⅴ 8.0.6軟件對工藝條件進行優(yōu)化，得到AMP最佳提取條件為：纖維素酶添加量1.35%、酶解溫度44.36℃、pH 值4.71、攪拌轉(zhuǎn)速669.94 r·min-1。此條件下，AMP提取量的預測值為26.98 mg·g-1。在實際生產(chǎn)中，考慮到可操作性，將最佳提取條件修正為：纖維素酶添加量1.35%、酶解溫度44℃、pH值4.7、攪拌轉(zhuǎn)速670 r·min-1。采用修正后的提取條件進行驗證試驗(n=3)，得到AMP提取量實測值為26.58±0.23 mg·g-1，與預測值26.98 mg·g-1的相對誤差為1.48%，進一步說明此模型對試驗的擬合度較好，得到的回歸方程在本試驗中有實際意義。

2.3 AMP的抗氧化活性

2.3.1 AMP的總還原力 AMP的總還原能力是利用對鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)測定來分析，吸光值越大，表明總還原力越強。由圖7可知，AMP具有一定的總還原能力，在0.02～0.20 mg·mL-1內(nèi)，隨著AMP濃度的增加，其總還原力不斷增強，且呈明顯的濃度依賴關(guān)系。當濃度為0.20 mg·mL-1時，AMP總還原力吸光值分別為0.58±0.004，同濃度下Vc的吸光值為1.22±0.005，表明AMP的總還原力弱于Vc。

圖7 AMP的總還原力Fig.7 Total reducing power of AMP

2.3.2 AMP對DPPH自由基的清除能力 由圖8可知，AMP對DPPH自由基清除能力表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，即隨著AMP濃度增加，DPPH自由基清除能力隨之增加。AMP和Vc清除DPPH自由基的IC50值分別為0.15、0.045 mg·mL-1，表明AMP具有較好的DPPH自由基清除能力。

圖8 AMP對DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH free radical scavenging ability of AMP

注:###表示與空白對照組相比差異極其顯著(P<0.001)；*、**、***分別表示與α-MSH模型組相比在0.05、0.01、0.001水平上差異顯著。

Note: Compared with the blank control group,###indicates extremely significant difference at 0.001 level. Compared with the α-MSH model group,*and**,***indicate significant difference at 0.05, 0.01 and 0.001 level, respectively.

2.3.3 AMP對ABTS自由基的清除能力 由圖9可知，AMP具有顯著清除ABTS自由基的能力，且清除率隨著濃度的增大先逐漸增強最后趨于恒定。AMP和Vc清除ABTS自由基的IC50值分別為0.05、0.04 mg·mL-1，表明AMP對ABTS自由基的清除作用與Vc相當。結(jié)合2.31.2.32可知，AMP的總還原力、對DPPH自由基和ABTS自由基清除作用的變化規(guī)律具有較好的一致性，進一步表明了多酚類物質(zhì)是祁白術(shù)的主要抗氧化活性成分[4]。

圖9 AMP對ABTS自由基的清除能力Fig.9 ABTS free radical scavenging ability of AMP

2.4 AMP對B16細胞的影響

由表4可知，在0.0025～0.02 mg·mL-1濃度下，AMP對B16細胞活性無顯著影響，與空白對照組相比，無統(tǒng)計學差異(P> 0.05)，表明后續(xù)試驗可采用此濃度進行研究。B16細胞經(jīng)α-MSH誘導后，細胞酪氨酸酶活性及黑色素合成量明顯增加，與空白對照組比較均具有極顯著性差異(P<0.001)，表明α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型建立成功。與α-MSH模型組相比，AMP濃度分別為0.005、0.01、0.02 mg·mL-1時，對細胞酪氨酸酶活性抑制率分別為9.31%、13.45%、30.11%，對黑色素合成抑制率分別為15.25%、26.88%、43.35%，差異均具有顯著性(P<0.05)。陽性對照組細胞酪氨酸酶活性及黑色素合成抑制率分別為22.03%、39.77%，表明AMP對細胞酪氨酸酶及黑色素合成的抑制效果強于熊果苷。綜上，AMP在一定程度上可通過調(diào)控細胞酪氨酸酶活性抑制黑色素的合成。

3 討論

多酚類物質(zhì)作為一類非常重要的植物次生代謝產(chǎn)物，具有很高的藥物和食用價值。多酚類物質(zhì)大多包裹在細胞壁中，采用傳統(tǒng)的固液萃取和溶劑浸提法提取效率低下，研究多酚提取工藝的優(yōu)化顯得尤為重要[24]。酶法作為提取生物活性成分的一種新興生物技術(shù)，能夠破壞以纖維素為主的細胞壁結(jié)構(gòu)，減少提取的傳質(zhì)阻力，使得多酚類物質(zhì)被充分釋放，提取率顯著提高，已被廣泛應用于天然活性物質(zhì)的提取[8-12]，但目前尚鮮見用于祁白術(shù)多酚的提取和制備。本試驗應用纖維素酶輔助提取祁白術(shù)中多酚類物質(zhì)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計方法優(yōu)化AMP提取工藝條件，在最佳工藝條件下AMP提取量，為26.58±0.23 mg·g-1，較未添加纖維素酶時提高了67.70%，表明應用本研究優(yōu)化的工藝條件，可提高祁白術(shù)多酚的提取率。

皮膚黑色素是由位于表皮基底層的黑色素細胞合成的高分子生物色素，黑色素的含量及分布決定了肌膚的呈色。皮膚長期暴露在紫外線、化學物質(zhì)等外界有害因素之下，會產(chǎn)生過量的自由基[25]。自由基可調(diào)節(jié)黑色素合成過程中的限速酶——酪氨酸酶的表達水平，過量自由基會激發(fā)酪氨酸酶對酪氨酸的氧化，促進黑色素的大量合成[26-27]。黑色素的過度合成不僅簡單地使皮膚變黑，而且可直接或間接導致皮膚出現(xiàn)炎癥、雀斑等，甚至會引發(fā)黑色素瘤，對機體造成危害[28-29]。研究表明，許多植物提取精華和中草藥中的化學成分可有效地清除自由基及抑制黑色素的合成[20,30]。本試驗結(jié)果表明，AMP具有較好的抗氧化活性，其總還原力、對DPPH自由基、ABTS自由基清除作用隨其濃度的增加而增強，且AMP的總還原力、對DPPH自由基、ABTS自由基清除作用的變化規(guī)律具有較好的一致性，說明多酚類物質(zhì)是祁白術(shù)的主要抗氧化活性成分。此外，AMP可顯著抑制α-黑素細胞刺激誘導的B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成，當AMP濃度為0.02 mg·mL-1時，對細胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成抑制率分別為30.11%、43.35%，陽性對照熊果苷(0.1 mg·mL-1)對細胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素合成的抑制率分別為22.03%、39.77%，表明AMP對黑色素生成的抑制效果強于市場上的美白劑熊果苷。綜上所述，祁白術(shù)多酚能夠顯著抑制α-MSH誘導黑色素的合成，其作用效果可能是通過有效清除過量自由基，進而調(diào)控黑色素合成過程中的限速酶——酪氨酸酶活性實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

本研究選用纖維素酶法提取祁白術(shù)中的多酚，經(jīng)響應面優(yōu)化后得到的最佳工藝條件為：纖維素酶添加量1.35%、酶解溫度44℃、pH值4.7、攪拌轉(zhuǎn)速670 r·min-1、料液比1∶30 g·mL-1、酶解時間20 min，此條件下，AMP提取量最高，為26.58±0.23 mg·g-1。統(tǒng)計學分析顯示，所選響應面模型擬合高，試驗誤差小，優(yōu)化后的提取工藝條件合理可行。本研究揭示了道地藥材祁白術(shù)具有顯著抗氧化和抑制黑色素合成活性，并明確了多酚類物質(zhì)是其發(fā)揮作用效果的物質(zhì)基礎(chǔ)。下一步將對祁白術(shù)多酚做進一步的分離純化，以鑒定出祁白術(shù)多酚抗氧化、抑制黑色素合成的主要活性化合物。