楊天佑 田 靜 張明霞 張 蕾

(1 河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

磷是作物生長發(fā)育所必需的重要營養(yǎng)元素之一，但土壤中的磷大部分具有難溶性，能被作物直接吸收利用的有效無機磷較低。針對土壤潛在磷源豐富而有效磷缺乏的現(xiàn)狀，開發(fā)能充分利用土壤潛在磷源的解磷微生物，對于緩解磷資源短缺，發(fā)展高效農(nóng)業(yè)具有重要意義[1]。目前已有關(guān)于高效解磷微生物的篩選及解磷機理探索的報道[2]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的解磷微生物有細菌[3]、放線菌和真菌[4]。研究表明，解磷真菌在數(shù)量和種類上雖少于解磷細菌，但其解磷能力及穩(wěn)定性一般要強于細菌[5]。微生物解磷機理的研究，在細菌中研究較為全面深入，而在真菌方面的研究較為滯后，無論細菌還是真菌，有機酸被研究者認為是解磷微生物解磷的關(guān)鍵物質(zhì)[6]。

低能離子束誘變自上世紀(jì)80年代被應(yīng)用于生物誘變遺傳育種以來，由于其具有獨特的輻射效應(yīng)，目前已被廣泛應(yīng)用于微生物育種，并取得了豐碩的成果[7-9]。近年來，前人對低能離子束誘變解磷微生物進行了大量的研究，如游銀偉等[10]通過氮離子束注入對枯草芽孢桿菌BacillussubtilisP-1進行誘變，篩選得到一株解磷突變菌株，解磷能力提高了48%。胡秀芳等[11]利用離子束注入技術(shù)選育膠質(zhì)芽孢桿菌BacillusmucilaginosusKrassilnikovKNP414的解磷突變菌株，也明顯提高了其解磷能力。低能離子束是一種新型的誘變源，其誘變生物體存在能量交換、能量沉積、質(zhì)量沉積及電荷交換4種效應(yīng)[12]，具有損傷低、突變譜寬、突變率高等特點[13]。目前國內(nèi)外離子束誘變解磷菌的研究誘變材料多為細菌，真菌離子束誘變的研究報道尚鮮見，利用離子束誘變解磷真菌，有望獲得離子束作用解磷真菌的誘變條件并可構(gòu)建高效的解磷真菌突變體。

本研究從作物根際土壤篩選解磷真菌，利用離子束構(gòu)建高效解磷突變體，并以有機酸作為關(guān)鍵物質(zhì)探討真菌的解磷機制，以期為闡明解磷真菌機理提供一定的理論依據(jù)，為高效解磷真菌的開發(fā)提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯葡萄瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0。

無機難溶性磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、NaCl 0.3 g、KC1 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、(NH4)2SO40.5 g、Ca3(PO4)25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5，其中Ca3(PO4)2經(jīng)充分研磨滅菌后加入。

真菌總DNA提取按照真菌DNA提取試劑盒(生物工程上海股份有限公司)說明書進行，真菌ITS序列擴增的通用引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 解磷真菌YTY的篩選 取河南科技學(xué)院試驗田小麥和棉花的根際土壤每株5 g于50 mL無菌水中，振蕩器充分混勻，靜置取上清液制備10-4、10-5和10-63個梯度的稀釋液處理，分別取每個稀釋處理菌懸液0.2 mL涂布于無機難溶性磷固體培養(yǎng)基，每處理設(shè)5次重復(fù)，28℃培養(yǎng)5 d，觀察有明顯解磷圈的真菌菌落，測量菌落的直徑大小(D菌落)和周圍透明圈的直徑大小(D透明圈)，D透明圈/D菌落作為初篩依據(jù)，挑取D透明圈/D菌落較大的真菌菌落轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基，4℃保存。

取2環(huán)解磷真菌的斜面孢子于100 mL無機難溶性磷液體培養(yǎng)基中，28℃、70 r·min-1條件下往復(fù)搖床培養(yǎng)5 d，每株菌設(shè)3次重復(fù)，鉬銻抗比色法[3]測定菌株的解磷能力，挑選解磷能力最強的解磷真菌，編號YTY，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 解磷真菌YTY的鑒定 將YTY菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)。用牙簽挑取YTY孢子，點接種于PDA平板，接種點附近插1 cm2的金屬片，28℃進行爬片培養(yǎng)，待菌絲體爬上金屬片后，用Quantu200環(huán)境掃描電鏡(美國FEI公司)進行觀察。

利用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌YTY，刮取平皿表面的菌絲體放入研缽中用液氮研磨，經(jīng)研磨后的菌絲體，采用真菌總DNA提取試劑盒(生物工程上海股份有限公司)提取其基因組DNA。利用真菌ITS序列的PCR通用引物，上游引物為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進行PCR擴增，擴增體系50 μL，包括50 μmol·L-1dNTPs 5 μL、10 μmol·L-1上游引物1 μL、10 μmol·L-1下游引物1 μL、3 U Taq plus DNA 聚合酶1 μL、10×PCR 反應(yīng)緩沖液5 μL，ddH2O 37 μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至寶生物工程(大連)有限公司測序，獲得其DNA序列，提交GenBank登錄，通過BLAST比對比較分析序列，利用 MEGA5.0軟件對YTY進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3 解磷真菌YTY的離子束誘變 取0.2 mL充分混勻的YTY孢子懸浮液(108CFU·mL-1)于潔凈無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，涂布均勻后置于超凈工作臺，無菌風(fēng)吹干制備YTY孢子菌膜，然后將培養(yǎng)皿置于Titan離子注入機微生物靶室內(nèi)，利用20、25、30 keV 3個能量低能氮離子進行輻射誘變，輻射劑量分別為5×1014、1×1015、5×1015、1×1016ions·cm-2，輻射處理設(shè)真空對照。注入后，用1 mL無菌水沖洗菌膜于試管中，充分打散混勻，稀釋10-3、10-4和10-5后涂布于無機難溶性磷平板。按照公式計算YTY存活率：

YTY存活率=輻照樣品的菌落數(shù)/真空對照的菌落數(shù)×100%

(1)。

YTY的初篩根據(jù)D透明圈/D菌落的大小進行，復(fù)篩采用搖床培養(yǎng)5 d，鉬銻抗比色法[3]測定菌株的解磷能力。

1.2.4 解磷真菌YTY培養(yǎng)液pH值的測定 取解磷真菌YTY 28℃培養(yǎng)5 d的無機難溶性磷培養(yǎng)液3 mL，利用PHS-3E型pH計(上海雷磁有限公司)測定pH值，每株菌設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 解磷真菌YTY培養(yǎng)液有機酸的測定 取1.2.3中的YTY培養(yǎng)液3 mL至離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，用1 mL的注射器注入ICS-2000型離子色譜儀(美國戴安公司)進行測定，所用色譜柱為DIONEX IonPac?AS11-HC陰離子交換柱(水系)，樣品流速為1.20 mL·min-1，柱溫為30℃，進樣體積為0.5 mL，根據(jù)Chromeleon色譜工作站的操作指南分析色譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷真菌YTY的篩選

由表1可知，通過初篩和復(fù)篩分離到13株解磷真菌(phosphate solubilizing fungi，PSF)。13株P(guān)SF都可在以磷酸三鈣為唯一磷源的無機難溶性磷平板上生長，并能產(chǎn)生明顯的透明圈，根據(jù)D透明圈/D菌落比值大小依次編號為PSF 1～PSF 13。13株菌中D透明圈/D菌落比值最小的為1.020，最大的為1.420。13株P(guān)SF除了PSF 2沒有測得解磷活性外，其他12株P(guān)SF均具有一定的解磷能力，其中PSF 13的解磷能力最強，為186.4 mg·L-1，命名為解磷真菌YTY。

表1 不同作物根際解磷真菌的篩選Table 1 Screening of PSP in rhizosphere of different crops

注：“-”表示未測得解磷效果。

Note: ‘-’ means unmeasured P solubilizing abilities.

圖2 解磷真菌YTY的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of phosphate solubilizing fungus YTY

2.2 解磷真菌YTY的生物學(xué)鑒定

由圖1-A可知，在PDA平板上解磷真菌YTY菌落由白色逐漸變?yōu)樯罹G色，最后為灰綠色，邊緣為白色，菌落較平坦，質(zhì)地絨狀，分生孢子易脫落。YTY的分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，帚狀枝由分生孢子梗上輪生的小梗組成，帚狀枝呈現(xiàn)單輪生(圖1-B)。進一步對比分析發(fā)現(xiàn)，解磷真菌YTY符合青霉屬(Penicillium)的生長特性，可初步鑒定為解磷青霉YTY。

注：A：解磷真菌YTY菌落；B：解磷真菌YTY的電鏡照(bar=30 μm)。Note: A: Colony of YTY. B: Electron microscope photo of YTY (Bar=30 μm).圖1 解磷真菌YTY的菌落及電鏡照Fig.1 Colony and electron microscope photo of phosphate solubilizing fungus YTY

系統(tǒng)進化樹顯示解磷真菌YTY與草酸青霉PenicilliumoxalicumSD123 KP639194.1的進化距離最近(圖2)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分生孢子結(jié)構(gòu)特征，鑒定解磷真菌YTY為草酸青霉Penicilliumoxalicum。

2.3 解磷青霉YTY的劑量存活效應(yīng)

由圖3可知，能量為20 keV時，5×1014、1×1015、5×1015、1×1016ions·cm-24個輻射處理下解磷青霉YTY存活率分別為62.3%、59.4%、48.6%、45.3%，即隨著離子束輻照劑量的增加，存活率呈逐漸降低的趨勢，未呈現(xiàn)HRS/IRR(hyper-radiosensitivity and induced radioresistance)效應(yīng)；能量為25 keV時，1×1016ions·cm-2輻射處理的解磷青霉YTY的存活率顯著高于5×1015ions·cm-2下的存活率(P<0.05)，其HRS/IRR效應(yīng)呈現(xiàn)不完全；能量為30 keV時，解磷青霉YTY在1×1015ions·cm-2輻射處理存活率顯著高于5×1014ions·cm-2和5×1015ions·cm-2輻射處理，HRS/IRR效應(yīng)明顯。表明30 keV能量下，對解磷青霉YTY可誘發(fā)HRS/IRR效應(yīng)，解磷真菌YTY的HRS/IRR效應(yīng)的研究結(jié)果為其離子束誘變最佳條件的確定提供了參考。

2.4 解磷青霉YTY誘變條件的探索及高效菌的篩選

由表2可知，誘變初篩共獲得解磷真菌YTY的正突變菌48株。20、25、30 keV能量下獲得正突變株分別為13、12、23株；5×1014、1×1015、5×1015、1×1016ions·cm-24個輻射處理下的正突變株分別為13、18、7、10株。其中，能量為30 keV、輻射劑量為1×1015ions·cm-2處理下，初篩獲得突變菌株數(shù)量最多。

對初篩獲得48株正突變株進一步進行搖床復(fù)篩，最后獲得解磷能力最高的突變體為p-1，其解磷能力為235.7 mg·L-1，較出發(fā)菌解磷真菌YTY提高了26.4%，獲得該菌株的誘變條件為30 keV，1×1015ions·cm-2氮離子，表明30 keV和1×1015ions·cm-2輻射條件下獲得的突變體不僅數(shù)量多且解磷效率也高，其可作為解磷真菌YTY誘變選育的最佳輻射條件。利用30 keV、1×1015ions·cm-2對p-1菌株進行誘變，最終獲得3株高效解磷突變株，編號分別為 p-1-1、p-1-2、p-1-3。3株菌的解磷能力分別為291.8、264.6、245.8 mg·L-1，較出發(fā)菌株解磷真菌YTY分別提高了56.88%、42.26%和32.15%(表3)。

表2 解磷真菌YTY初篩突變菌株在不同輻射處理下的突變菌分布Table 2 Distribution of mutants of phosphate solubilizing fungus YTY under different irradiation conditions

表3 解磷真菌YTY高效突變菌解磷能力Table 3 Phosphate solubilizing ability of efficient mutants of YTY

2.5 解磷青霉YTY產(chǎn)酸的分析

利用離子色譜法測定解磷真菌YTY無機難溶性磷的培養(yǎng)液(培養(yǎng)5 d)，由圖4可知，共測得3個明顯的吸收峰，3個峰保留時間分別為6.6、7.3、15.6 min。進一步分析發(fā)現(xiàn)這3個峰保留時間與乳酸、乙酸和草酸3種有機酸的單一和混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間相同，可判斷3種有機酸分別為乳酸、乙酸和草酸，培養(yǎng)液中這3種有機酸含量分別為0.040 1、0.038 4、0.064 3 mmol·L-1，此時培養(yǎng)液的pH值為2.5。表明解磷真菌YTY溶解磷酸三鈣過程中主要產(chǎn)生了3種有機酸。

注：a、b、c分別表示乳酸、乙酸、草酸。Note: a, b and c mean the absorption peaks of lactic, acetic, oxalic,respectively.圖4 解磷真菌YTY有機酸產(chǎn)生的情況Fig.4 Production of organic acids in phosphate solubilizing fungus YTY

由圖5可知，突變株p-1-1、p-1-2、p-1-3培養(yǎng)液的pH值分別為2.1、1.9和2.0，三者之間無顯著差異，但是3株突變菌培養(yǎng)液的pH值均顯著低于CK(P<0.05)，表明3株突變菌酸化環(huán)境的能力均高于CK。p-1-1菌株所產(chǎn)乳酸、乙酸、草酸和總酸含量分別較CK提高了113.3%、60.3%、131.2%和45.1%，p-1-2菌株分別較CK提高了131.2%、62.2%、43.1%和52.9%，p-1-3菌株分別較CK提高了30.4%、14.1%、43.8%和11.9%。離子束誘變使得解磷青霉YTY產(chǎn)乳酸、乙酸、草酸和總酸的能力得到不同程度的提高。綜上，解磷青霉YTY產(chǎn)有機酸能力與其解磷能力呈正相關(guān)，表明解磷青霉YTY的解磷能力與其產(chǎn)有機酸的能力密切相關(guān)。

圖5 解磷真菌YTY突變菌株的pH值及產(chǎn)酸的分析Fig.5 Analysis of pH and organic acids of YTY mutants

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的解磷真菌有60多種，主要屬于鏈格孢屬(Alternaria)、 曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、木霉屬(Trichoderma)等，其中報道較多的為曲霉屬和青霉屬，且均具有較高的解磷能力[14]。林啟美等[15]對一些細菌和真菌的解磷能力進行對比研究，發(fā)現(xiàn)細菌溶解磷礦粉的能力為26.92～43.34 mg·L-1，而大多數(shù)真菌溶解磷礦粉的能力為59.64～145.36 mg·L-1，真菌比細菌溶解磷礦粉的能力更強。Nath等[16]發(fā)現(xiàn)2株青霉屬真菌，具有較強的溶磷能力，其解磷能力最高達到84.25和86.1 mg·L-1。本研究從作物根際土壤篩選獲得的解磷草酸青霉YTY，具有高解磷活性，其解磷能力為186.4 mg·L-1，高于前人報道的細菌和同類真菌[16-17]。本研究解磷真菌YTY的獲得為解磷真菌解磷機理的研究及其開發(fā)利用提供了重要的材料，同時菌株YTY來源于作物根際土壤，可為根際真菌解磷促生效應(yīng)的研究提供材料。

離子束誘變技術(shù)的注入離子種類、能量、劑量等條件可選擇范圍較大，導(dǎo)致其最佳輻照參數(shù)的確定較為困難，若能快速有效獲得低能離子誘變真菌YTY的最佳誘變條件，可極大提高YTY離子束誘變選育工作的效率[13]。本研究發(fā)現(xiàn)30 keV的低能氮離子輻射YTY菌株可誘發(fā)HRS/IRR效應(yīng)，分析48株初篩正突變菌株來源時，發(fā)現(xiàn)30 keV、1×1015ions·cm-2輻照處理下的突變菌較多且解磷效果最好，且該輻射條件與YTY的IRR效應(yīng)誘發(fā)條件一致，利用IRR效應(yīng)劑量誘變可能獲得理想突變體。目前，國內(nèi)外也有類似報道[18]，且在類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)[19]、酒精酵母(Saccharomycescerevisiae)[20]、不動桿菌(Acinetobactersp.)[18]等微生物中都發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律。輻射中劑量存活的HRS/IRR效應(yīng)可能與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)[21-22]，已有研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷，特別是DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)的損傷修復(fù)狀態(tài)在HRS/IRR效應(yīng)誘發(fā)中作用顯著[23]。 前期研究也發(fā)現(xiàn)低能氮離子注入大腸桿菌MG1655可誘發(fā)HRS/IRR效應(yīng)，其誘發(fā)與參與DNA易錯修復(fù)的recA基因[24]、參與自由基修復(fù)的SOD和CAT密切相關(guān)，推測IRR效應(yīng)誘發(fā)時，離子束對YTY細胞內(nèi)DNA有較大的損傷作用，啟動了DNA的修復(fù)機制，DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的啟動不僅使得大量損傷細胞得以存活，導(dǎo)致其存活率增加，且此時YTY細胞內(nèi)DNA應(yīng)急修復(fù)也極大提高了微生物的突變率[25]。表明利用IRR輻射敏感劑量可加速青霉YTY的誘變選育，本研究也為利用離子束IRR效應(yīng)構(gòu)建高效解磷突變體提供了參考和依據(jù)。

微生物參與無機磷解磷的機理大致可分為4種，包括有機酸、氫質(zhì)子、蛋白質(zhì)、螯合作用[26]，其中有機酸是解磷微生物解磷的關(guān)鍵物質(zhì)[27-28]。Chai等[29]從明礬礦中分離到1株青霉PSM11-5，發(fā)現(xiàn)其解磷作用與葡萄糖酸、檸檬酸關(guān)系密切。目前國內(nèi)外已有青霉解磷機制的研究報道，如Ahuja等[30]認為馬氏擬青霉(Paecilomycesmarquandii)AA1 產(chǎn)生的檸檬酸和草酸是導(dǎo)致解磷的重要條件；Mendes等[31]發(fā)現(xiàn)變灰青霉菌(Penicilliumcanescens)產(chǎn)生的檸檬酸、葡萄糖酸、草酸是其溶解磷酸鈣的主要產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)解磷青霉YTY降解磷酸三鈣過程中，產(chǎn)生了3種有機酸，即乳酸、乙酸、草酸，也表明YTY解磷過程與有機酸關(guān)系密切。下一步的研究可以重點探討解磷真菌YTY的基因在離子束誘變中發(fā)生了哪些突變。

4 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)及分子學(xué)方法鑒定表明YTY為草酸青霉(P.oxalicum)。30 keV氮離子輻照為解磷真菌YTY的最佳誘變條件，可誘發(fā)HRS/IRR效應(yīng)，共獲得了3株高效解磷突變株；乳酸、乙酸、草酸為YTY解磷的主要有機酸，YTY產(chǎn)酸能力與其解磷能力關(guān)系密切，但乳酸、乙酸、草酸3種有機酸對YTY解磷貢獻的大小，尚有待進一步研究。本研究結(jié)果為解磷青霉的離子束誘變選育提供了參考，為探明青霉解磷的機理及開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)和生物材料。