李 穎 唐 凌,* 梁國(guó)魯 吳 頔 黨江波 項(xiàng) 萱

(1 重慶市園林綠化服務(wù)中心，重慶 400042；2 西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；3 上海鮮花港企業(yè)發(fā)展有限公司，上海 201303)

桔梗[Platycodongrandiflorus(Jacq.)A. DC.]為桔?？贫嗄晟荼局参?，其花有紫藍(lán)、翠藍(lán)、凈白、粉、黃等顏色；其根可入藥，有止咳祛痰、宣肺、排膿等作用，具有較高的觀賞和藥用價(jià)值[1]。目前，我國(guó)對(duì)桔梗的研究主要集中于種質(zhì)資源和藥用方面[2-5]，對(duì)其從觀賞價(jià)值方面的品種選育研究并不常見。僅有吉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出桔梗觀賞品種九桔蘭花[6]；陳寶芳等[7]和魏建和等[8]利用選擇育種獲得了適于觀賞的粉花新品系;王志芬等[9]采用航天育種獲得了發(fā)生變異的桔梗單株。我國(guó)作為桔梗的原產(chǎn)地之一，種質(zhì)資源豐富，但從觀賞角度選育的桔梗品種遠(yuǎn)低于其他國(guó)家。

離子束誘變育種技術(shù)是利用加速的氣體離子(等離子體)轟擊植物種子、胚芽、花粉等生物材料，使之產(chǎn)生基因突變，從而選育出新的品種[10]。離子束注入可以分為高能離子束和低能離子束兩種，常用的離子有活性離子N+、C+、O+、H+、P+，惰性離子Ar+、Ne+，金屬離子Fe+、Zn2+等。離子束誘變技術(shù)作為我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的定向遺傳育種的新方法和新途徑[11]，與傳統(tǒng)的X射線、γ射線等輻射技術(shù)相比，具有作用效應(yīng)局部、可控、可選擇、較高突變率、突變體穩(wěn)定較快等優(yōu)勢(shì)，目前已應(yīng)用于植物的突變體產(chǎn)生、新品種培育、遺傳物質(zhì)介導(dǎo)、遠(yuǎn)緣雜交克服等方面。目前已有將離子束誘變技術(shù)應(yīng)用于美女櫻[12]、菊花[13]、玫瑰[14]等花卉育種的研究報(bào)道。獲得了一批在株高、花形、花色、花朵大小和數(shù)量，以及葉形和葉色上變化明顯的突變體，部分研究通過后期選育獲得了新品種。

低能氮離子作為活性離子之一，常用在植物的遺傳育種和遺傳修飾上，有研究表明，在花卉上的應(yīng)用效果顯著。如辛督強(qiáng)等[15]采用N+注入中國(guó)鳳仙花種子，M0植株花瓣、花色發(fā)生了變化，部分植物變矮花朵上移；趙曼禎[16]在此基礎(chǔ)上，通過3年試種，反復(fù)淘汰、選優(yōu)，獲得春霞和朝陽2個(gè)觀賞新品種；鄒東旺等[17]采用N+注入太空3號(hào)子蓮種子，選育出京廣1號(hào)子蓮新品種，較太空蓮品種增產(chǎn)15.9%；張濤等[18]用N+注入鳳仙花種子，選育了低莖和高莖2個(gè)變異品種。但將N+離子注入桔梗進(jìn)行新材料創(chuàng)制的研究尚鮮見報(bào)道。本研究將不同能量和劑量的低能氮離子注入桔梗的干種子，觀察種子萌發(fā)和植株性狀變化，并從M0篩選變化單株，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，分析變化位點(diǎn)，以期為桔梗N+注入誘變育種提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桔梗種子(我國(guó)南方常用栽培品種，紫花桔梗)由重慶綠泉園藝有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 N+注入 采用西南大學(xué)離子束生物工程裝置(南京恒樂機(jī)電有限公司)進(jìn)行低能氮離子注入。能量分別設(shè)置為25 KeV和35 KeV。劑量分別為0(CK)、2×1016、4×1016、6×1016、8×1016、10×1016、12×1016N+·cm-2。每處理500粒種子，每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 播種栽培 將經(jīng)低能氮離子注入處理后的種子和對(duì)照種子與干河沙拌勻后，均勻播撒于苗床?；|(zhì)為腐殖土+壤土+河沙(v∶v∶v=1∶1∶1)，基質(zhì)鋪于苗床，約15 cm厚。播種后覆蓋基質(zhì)，澆透水，蓋薄膜保濕，設(shè)置遮陽網(wǎng)遮陽。播種后30 d統(tǒng)計(jì)存活數(shù)，計(jì)算存活率，并進(jìn)行比較分析。出苗后，觀察比較葉形變化。植株生長(zhǎng)定型后，每個(gè)處理隨機(jī)抽取6株對(duì)其株高、分枝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。從開花初期開始，對(duì)其花數(shù)、花形和開花早晚進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.3 ISSR分析 變化單株DNA提取采用CTAB法[19]。桔梗ISSR總反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.6 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，Mg2+(25 mmol·L-1)2.0 μL,引物(10 μmol·L-1)1 μL，DNA模板(50 ng·μL-1)1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。本研究選取20個(gè)引物[4,20]用于PCR擴(kuò)增，選用的引物及其序列詳見表1。ISSR-PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.3 min，45個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min[4,20]。采用瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為1.0%，上樣體積6 μL，電泳電壓120 V，時(shí)間40 min，在UVP凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并拍照。

表1 本研究所采用的20條ISSR引物Table 1 20 ISSR primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)植株表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入對(duì)桔梗種子存活率的影響

由表2可知，CK的存活率為25.6%；25 KeV，12×1016N+·cm-2處理下的存活率最高，為77.0%；35 KeV，10×1016N+·cm-2處理下的存活率最低，僅為0.4%。能量為25 KeV時(shí)，隨著劑量的增加，桔梗的存活率逐漸提高；能量為35 KeV時(shí)，低劑量(2×1016N+·cm-2)處理對(duì)桔梗存活有一定的促進(jìn)作用，但隨著劑量的增加，桔梗存活率急速降低，表明高能量和高劑量能明顯抑制桔梗的存活。

2.2 N+注入對(duì)桔梗植株性狀的影響

2.2.1 N+注入對(duì)桔梗株高和分枝數(shù)的影響 由表3可知，能量為25 KeV時(shí)，不同處理間株高差異均不顯著；能量為35 KeV時(shí)，12×1016N+·cm-2處理的株高顯著低于CK；能量為25 KeV時(shí)，4×1016N+·cm-2和10×1016N+·cm-2處理的分枝數(shù)明顯低于CK，2×1016N+·cm-2處理明顯高于CK；能量為35 KeV時(shí)，各處理間分枝數(shù)差異均不顯著。

表2 N+注入對(duì)桔梗種子存活率的影響Table 2 Effect of N+ injection on the survival rate of Platycodon grandiflorus seeds

表3 N+注入對(duì)桔梗株高和分枝數(shù)的影響Table 3 Effect of N+ injection on plant height and branches number of Platycodon grandiflorus

注：同一列不同小寫和大寫字母分別表示在0.05和0.01水平差異顯著。“-”表示全部死亡。

Note: Different lowercase letters and capital letters in the same column indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively. ‘-’indicate total died.

2.2.2 N+注入對(duì)桔梗花數(shù)的影響 與CK相比，能量為35 KeV時(shí)，8×1016N+·cm-2處理的花數(shù)明顯減少(圖1)；其他處理的花數(shù)差異不明顯。

2.2.3 N+注入對(duì)桔梗花形的影響 經(jīng)N+注入處理的花形部分表現(xiàn)為只有1個(gè)花瓣(2-B)，或花冠極小(2-B)，花瓣之間裂度深(圖2-C)，花萼向類似花瓣結(jié)構(gòu)方向變化(圖2-D)。

2.2.4 N+注入對(duì)桔?；ㄆ诘挠绊?CK和大多數(shù)N+注入處理在均6月末-7月初開始開花。但能量為35 KeV時(shí)，8×1016N+·cm-2和12×1016N+·cm-2處理的植株開花較晚，于8月初開始開花；其中有1株葉形正常但植株矮小，至在8月中旬也未見花蕾(圖3-B)。

2.3 桔梗變異單株的ISSR分析

2.3.1 桔梗DNA的提取 本試驗(yàn)共提取了8個(gè)變化單株(表4)和1個(gè)對(duì)照單株的DNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA濃度在242.5～1 061.5 ng·μL-1之間。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA大小和完整性，都能顯示清晰條帶，可用于PCR擴(kuò)增。

表4 8個(gè)桔梗變化單株來源和變異類型
Table 4 8 Plants specific sources and variation ofPlatycodongrandiflorus

編號(hào)No.變異來源Source of variation變異類型Variation type編號(hào)No.變異來源Source of variation變異類型Variation type135 KeV,8×1016N+·cm-2開花晚,花數(shù)少,植株矮小535 KeV,6×1016N+·cm-2花萼向類似花瓣結(jié)構(gòu)方向變化235 KeV,8×1016N+·cm-2開花晚,花數(shù)少,植株矮小635 KeV,4×1016N+·cm-2花萼向類似花瓣結(jié)構(gòu)方向變化335 KeV,8×1016N+·cm-2開花晚,花數(shù)少,植株矮小735 KeV,12×1016N+·cm-2開花晚,花數(shù)少,植株矮小435 KeV,8×1016N+·cm-2花瓣間分裂深,花數(shù)少,植株矮小835 KeV,12×1016N+·cm-2花數(shù)少,植株矮小

注：A:桔梗正常開花(CK)；B:能量為35 KeV時(shí)，8×1016N+·cm-2處理的桔梗開花。
Note: A: Blossom of normal plants (CK). B: Blossom of plants treated by 35 KeV, 8×1016N+·cm-2injection.

圖1 花量變異桔梗開花情況Fig.1 Blossom of Platycodon grandiflorus plants with flower number mutant

2.3.2 ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析 由表5可知，20條引物中有15條可擴(kuò)增出清晰條帶，共擴(kuò)增出250條條帶，其中多態(tài)性條帶87條，占擴(kuò)增總數(shù)的34.80%。每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)存在差異，其中引物UBC808擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，為28條；不同引物的多態(tài)性條帶數(shù)也存在差異，引物UBC811擴(kuò)增多態(tài)性條帶最多，為15條，引物UBC818擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為0條；引物UBC855多態(tài)性比率最高，為92.31%，引物UBC818最低，為0%。

2.3.3 變化位點(diǎn)分析 電泳后獲得的DNA片段圖譜，無條帶的記為“0”，有條帶的記為“1”。引物UBC855對(duì)9個(gè)單株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果表明，大多數(shù)變化單株發(fā)生了相同位點(diǎn)的缺失或增加，如引物UBC855擴(kuò)增的條帶與CK比較，條帶1相同位點(diǎn)增加，條帶2相同位點(diǎn)缺失(圖4)，表明N+注入引起了桔梗DNA水平上某些特定位點(diǎn)或片段的增加或缺失。

注：A: 桔梗正常花形(CK)；B: 僅有單個(gè)花瓣；C: 深裂；D：類似花瓣的花萼。Note：A: Normal flower type(CK). B: Flower sith only one petal. C: Flower with drastic crack petals. D: Petals-like calyxes.圖2 變異花形與正?；ㄐ伪容^Fig.2 The comparison of mutant flower type and normal flower type

3 討論

大量研究表明，離子注入能影響花卉的生長(zhǎng)發(fā)育，使植株表型發(fā)生變化，如劉志高等[21]將能量為 30 KeV·10mA-1,劑量分別為5、25、50、100、300、500、700、900×1016ions·cm-2的Ti離子注入石蒜和換錦花種子，發(fā)現(xiàn)二者的發(fā)芽率分別呈“馬鞍型”和“雙馬鞍型”的變化趨勢(shì)。毛培宏等[22]利用氮離子注入10種花卉種子，均不同程度地提高了種子的出苗率。本研究結(jié)果表明，低能量的氮離子能提高桔梗種子的存活率，高能量的氮離子，顯著抑制了桔梗的存活率。但本研究結(jié)果與張瑞博等[23]的結(jié)果不一致，其認(rèn)為不同濃度的氮離子對(duì)桔梗種子的萌發(fā)均起抑制作用，原因可能是其選擇的氮離子能量較高造成的。

表5 擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)及多態(tài)性Table 5 The amplification bonds and its polymorphism

注：“-”表示條帶不清晰，無法統(tǒng)計(jì)。

Note: ‘-’ indicates the bonds are unclear and cant’t be counted.

注：M：Maker(DL 2 000)；CK：未處理植株；1～8：變異植株。Note： M: Maker(DL 2 000); CK: Control plant. 1-8: Mutant plants.圖4 引物UBC855對(duì)未處理植株和8個(gè)變異單株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.4 Electrophoretogram of products amplified by ISSR primer UBC855 from control plant and 8 mutant plants of Platycodon grandiflorus

李俊等[24]將不同能量和劑量的鐵離子和鋁離子分別注入一品紅種子，發(fā)現(xiàn)各處理對(duì)其株高、冠幅和花序長(zhǎng)的影響均極顯著。辛督強(qiáng)等[15]將氮離子注入中國(guó)鳳仙花種子，發(fā)現(xiàn)其花瓣重瓣，花型向茶花型、月季型和荷花型變化，花色更艷麗，植株矮化、花朵上移。宋威等[25]將銅離子和鐵離子分別注入菊花種子，M1平均株高明顯矮化，冠幅增大，鐵離子注入株中出現(xiàn)一朵花上有2種顏色的現(xiàn)象。呂杰等[26]研究不同劑量氮離子注入苜蓿種子后對(duì)發(fā)芽及幼苗生理生化變化的影響，發(fā)現(xiàn)存活劑量效應(yīng)應(yīng)曲線呈“馬鞍型”，同時(shí)不同劑量不同程度提高了苜蓿過氧化酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性。本試驗(yàn)中也有8個(gè)桔梗單株在花形、花朵數(shù)、株高等方面發(fā)生了顯著變化。黃青等[27]應(yīng)用紅外和拉曼顯微光譜技術(shù)對(duì)離子輻射作用下的細(xì)胞和微生物進(jìn)行觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)徑輻射處理的細(xì)胞中蛋白質(zhì)、核酸、多糖等的含量和分布發(fā)生了明顯變化，同時(shí)DNA受到了損傷。謝璐[28]以低能N+離子束誘導(dǎo)獲得了穩(wěn)定的粉色和紅色鳳仙花突變體，并用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)鳳仙花突變體和對(duì)照株的核基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和克隆測(cè)序，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)突變體堿基發(fā)生了不同程度的轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。本試驗(yàn)對(duì)變化單株和對(duì)照單株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)率為34.80%，有相同位點(diǎn)的缺失和增加。但DNA水平上的具體變化類型、導(dǎo)致表型的變化機(jī)理、變化性狀能否穩(wěn)定遺傳，以及突變體下一代是否會(huì)發(fā)生新的變化，還有待深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，低能量的氮離子能提高桔梗種子的存活率，高能量的氮離子能顯著抑制桔梗的存活率；氮離子注入可以引起桔梗的生物學(xué)性狀改變，變異植株存在ISSR位點(diǎn)的增加或缺失現(xiàn)象。后續(xù)將對(duì)變異植株進(jìn)行繁育，通過試驗(yàn)探討其在實(shí)際生產(chǎn)中的價(jià)值，并對(duì)變異植株進(jìn)行深入研究，以闡明其變異發(fā)生的分子機(jī)理。本研究結(jié)果為桔梗氮離子注入誘變育種提供了一定的理論參考。