賈良良 ，陳 達 ，2，許麗梅 ，李 慧 ，曾建偉 ，葉錦霞 ，王麗麗 ，葉蕻芝 ，4，李西海 ，4

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350003；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；4.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是在生物因素與生物力學(xué)因素相互聯(lián)合、共同作用下出現(xiàn)的生物學(xué)紊亂最終導(dǎo)致的病變結(jié)果［1］，好發(fā)于中老年人，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點問題。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)表達紊亂是OA的關(guān)鍵病理過程［2］，白細胞介素 1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）是引起基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）等高表達的關(guān)鍵因素［3］，從而導(dǎo)致蛋白多糖、Ⅱ型膠原合成和降解之間的穩(wěn)態(tài)失衡?；诟文I虧虛則筋骨失養(yǎng)是骨關(guān)節(jié)炎的病理基礎(chǔ)，臨床上中藥復(fù)方治療骨關(guān)節(jié)炎多從肝腎論治，并配合隨證加減，其療效可靠。藥效成分的復(fù)雜多樣是中藥復(fù)方多靶點治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是探索天然藥物治療骨關(guān)節(jié)炎作用機制研究的重點領(lǐng)域。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎壯筋湯具有多層次、多途徑抑制骨關(guān)節(jié)炎筋骨失養(yǎng)的作用，但其具體的作用靶點尚不清楚。微小RNA（miRNA）是基因表達調(diào)控的關(guān)鍵因素，也是篩選骨關(guān)節(jié)炎治療靶點研究的熱點。因此，本研究以miR-140介導(dǎo)軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡為切入點，初步探討補腎壯筋湯調(diào)控軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡、抑制骨關(guān)節(jié)炎筋骨失養(yǎng)的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級4周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，合格證號：SCXK（滬）2012-0001。

1.2 實驗試劑與儀器 補腎壯筋湯方藥（福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂）；U0126（美國 CST公司）；脂多糖（LPS）、Ⅱ型膠原酶（美國 Sigma 公司）；甲苯胺藍（ 國 藥 集 團 化 學(xué) 試 劑 有 限 公 司 ）；TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒（美國R&D公司）；低糖DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清FBS（美國Gibco公司）；MMP-13抗體、彩色預(yù)染蛋白 marker（美國Thermo Fisher 公 司 ）；MMP-13、MMP-3、ADAMTS5抗體（美國 Santa Cruz公司）；β-actin抗體（美國Abcam公司提供）；二抗：羊抗兔（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；封閉用羊血清（北京索萊寶科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（強）、Trizol（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；mRNA提取試劑盒、miR-140引物、miRNA提取試劑盒（美國Taqman公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；9600 DNA擴增儀（美國PE公司）；7500型實時定量PCR儀（美國ABI公司）

2 實驗方法

2.1 軟骨細胞鑒定 取4周齡SPF級SD雄性大鼠膝關(guān)節(jié)，于超凈臺分離膝關(guān)節(jié)，將手術(shù)刀片剝離的脛骨平臺及股骨髁軟骨置于含有PBS的培養(yǎng)皿中，切成1 mm3大小的塊狀。PBS漂洗后加入0.2%的Ⅱ型膠原酶消化軟骨，置恒溫孵育箱（5%CO2），2 h／次收取上清，1 000 r／min 離心 5 min，將細胞沉淀中加入4 mL培養(yǎng)液置于恒溫孵育箱，48 h更換培養(yǎng)液。此為獲取的原代軟骨細胞。原代軟骨細胞長至90%時，傳代，第二代軟骨細胞，以1×105個／mL接種于含有細胞爬片的6孔板中。二代軟骨細胞培養(yǎng)72 h后，PBS漂洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗，經(jīng)甲苯胺藍（1%）浸染10 min，最后以無水乙醇漂洗，待晾干，中性樹脂封片；同法，經(jīng)多聚甲醛（4%）固定 30 min，PBS 漂洗，封閉 30 min，吸凈封閉液，陽性組為軟骨細胞孵育ColⅡ（4℃過夜），而陰性組為不加有ColⅡ 孵育（4℃過夜）的軟骨細胞，PBS洗滌，室溫下孵二抗，PBS洗滌，DAB顯色4 min左右，蘇木素浸染10 s左右，流水清洗，待晾干，中性樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。

2.2 造模與干預(yù) 本實驗炎癥軟骨細胞模型，為經(jīng)10 ng／mL的LPS干預(yù)對數(shù)生長期的二代軟骨細胞（長至90%）8 h誘導(dǎo)。培養(yǎng)的二代軟骨細胞分為正常組、模型組、抑制劑組、氨基葡萄糖組和補腎壯筋湯組?？瞻捉M，常規(guī)培養(yǎng)；模型組，加LPS 10 ng／mL；抑制劑組，加 U0126 10 ng／mL干預(yù) 30 min，加 LPS 10 ng／mL；氨基葡萄糖組，加氨基葡萄糖 1.35 μg／mL＋LPS 10 ng／mL；補腎壯筋湯組，加補腎壯筋湯200 μg／mL＋LPS 10 ng／mL，各組干預(yù) 8 h。

2.3 炎性因子檢測 收集各組干預(yù)8 h后的細胞上清液，按IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書處理細胞上清液并嚴謹操作，用多功能酶標(biāo)儀（波長為450 nm）檢測各組細胞上清液中IL-1β、TNF-α的表達量。

2.4 Western blot法檢測軟骨細胞相關(guān)蛋白表達采用RIPA裂解液提取細胞蛋白，BCA法測樣本蛋白濃度。吸取20 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后室溫封閉1 h，棄封閉液，4℃下分別與MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、RAF 和 β -actin（1∶1 000）一抗孵育過夜，用 TBST 洗膜；孵二抗（1∶2 000），搖床室溫孵育 1 h，用 TBST 搖床洗膜；于ECL顯影液下反應(yīng)1 min，曝光、顯影。用Image Lab軟件分析獲取各蛋白條帶灰度值。

2.5 qRT-PCR檢測軟骨細胞mRNA表達 采用Trizol一步法常規(guī)提取關(guān)節(jié)軟骨總RNA，測定RNA樣本濃度，逆轉(zhuǎn)錄。本實驗引物序列采用Primer 5軟件設(shè)計：MMP-3上游5'-GGAGTAATCGCATTGT GAGAGTC-3'，下游 5'-GGTTCCAGCCACGCATAGT C-3'；MMP-13 上 游 5'-ATGATGATGAACGATGGA CAGATG-3'，下游 5'-TGCTACACATTGGTAAGGTC TCAG-3'；ADAMTS4 上游 5'-GCAGAGTCCGAACG AGTTTACG-3'，下游 5'-TAGTGCCAGTTCTGTGCG TCG-3'；ADAMTS5 上游 5'-GTCTCAGCATTGACCT TCCGTG-3'，下游 5'-ACAGGGAGTTCCATCTGCCA CC-3'；RAF 上游 5'-AGACGAATGGAAGAGCCTGA-3'，下 游 5'-GGGATGGACAGAACAGAAGC-3'；GAPDH上游 5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3。反應(yīng)體系：QRT-PCR SYBR Green Master Mix 10.5 μL；上游引物 0.5 μL；下游引物 0.5 μL；cDNA 2 μL；超純水6.5 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，預(yù)變性；95 ℃10 s，變性，60℃ 34 s，退火延伸，行40個循環(huán)擴增。同時注意擴增曲線趨勢走向，以2-△△CT相對定量法計算各mRNA相對表達量。

2.6 qRT-PCR檢測軟骨細胞miR-140表達 按照miRNA提取試劑盒說明書操作，提取大鼠軟骨細胞中總 miRNA，逆轉(zhuǎn)錄后取 10 ng（5 μL）的總miRNA，進行 qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×TaqMan Universal PCR Master Mix，10.0 μL；20 ×TaqMan Assay 1.0 μL；逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物＋RNase-free water 9.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，行40個循環(huán)。密切關(guān)注擴增曲線，以2-△△CT相對定量法計算miRNA-140相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細胞鑒定 Ⅱ型膠原酶免疫組化染色顯示，陽性組胞漿為棕黃色，陰性對照組胞漿未染色（圖1-A、1-B）；甲苯胺藍染色顯示，胞漿內(nèi)出現(xiàn)紫偏藍的異染顆粒狀（圖1-C），提示本實驗培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。

圖1 軟骨細胞鑒定（×200）

3.2 5組軟骨細胞IL-1β和TNF-α表達量的比較見表1。

3.3 5組軟骨細胞相關(guān)蛋白表達 見圖2。

3.4 5組軟骨細胞相關(guān)基因表達 見圖3。

3.5 5組軟骨細胞miR-140的表達 與正常組相比，模型組 miR-140表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組相比，抑制劑組、氨基葡萄糖組和補腎壯筋湯顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），見圖 4。

4 討 論

基于肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)是OA的病理基礎(chǔ)，結(jié)合中醫(yī)骨傷“筋-骨”的病機演變規(guī)律，提出OA的治則以補腎柔肝為主（治痿），輔以活血祛風(fēng)（治痹）［4］，采用補腎壯筋湯，以熟地黃、山茱萸為君，奏滋補肝腎、填精益髓之功；續(xù)斷、杜仲、五加皮為臣，助君補肝腎，又可強筋骨；當(dāng)歸、白芍、茯苓及青皮共為佐，以活血斂陰，疏肝理氣；牛膝為使，可活血通經(jīng)，引藥入經(jīng)，直達病所，又可強筋骨，補肝腎，諸藥共奏補腎柔肝之效。

表1 5組軟骨細胞IL-1β和TNF-α 的表達量（x±s）pg／mL

圖2 補腎壯筋湯干預(yù)后5組軟骨細胞相關(guān)蛋白表達

圖3 補腎壯筋湯干預(yù)后5組軟骨細胞相關(guān)基因表達

圖4 補腎壯筋湯干預(yù)后軟骨細胞miRNA-140表達

在OA病程中，TNF-α不僅有效調(diào)節(jié)IL-1β的表達，可引起前誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，所以TNF-α、IL-1β有“前炎癥因子”之稱［5］。 IL-1β 可誘導(dǎo)基質(zhì)降解酶MMPs和ADAMTS的表達，ADAMTS5的表達量增加與軟骨基質(zhì)降解成正相關(guān)，在OA的形成過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。IL-1β通過上調(diào)MMP-3的表達，使軟骨基質(zhì)合成減緩，最終引發(fā)軟骨退變［8］。在膠原蛋白降解中，MMP-3發(fā)揮重要作用，其可激活放大MMP-13對軟骨基質(zhì)的降解能力，MMP-3、MMP-13會致使Ⅱ型膠原降解，使關(guān)節(jié)軟骨的損傷加重［9］。研究表明，氨基葡萄糖可抑制血清中MMP-3的表達［10］，刺激軟骨細胞再生，進而改善關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)，達到軟骨組織修復(fù)的作用［11］。研究表明，補腎壯筋湯可減輕炎癥反應(yīng)，抑制TNF-α、IL-1β在血清中的表達，使軟骨基質(zhì)降解受到抑制，延緩軟骨退變發(fā)生及骨贅的形成進程［12］。本實驗采用LPS（10 ng／mL）干預(yù)軟骨細胞8 h，建立軟骨細胞炎癥模型［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，補腎壯筋湯和氨基葡萄糖均可下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達，使RAF表達受抑制，進而使MMPS和ADAMTS的表達下降，說明二者均可有效延緩炎癥反應(yīng)，抑制軟骨基質(zhì)降解，延緩OA的病理進程。

在MAPK信號通路中，ERK1／2通路為其下游的一支，當(dāng)受外來刺激時RAS首先被激活，產(chǎn)生串連式反應(yīng)，被活化的RAS繼而激活RAF，進而激活MEK1／2，使 p-ERK1／2 產(chǎn)生活化［14］，進而進入細胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，從而引起軟骨的病變，最終形成 OA［15］。 因此，ERK1 ／2信號的活化對軟骨細胞病變起關(guān)鍵作用［15］。ERK1／2信號通路中，其特異性抑制劑可下調(diào)IL-1β等炎性因子的分泌［16］。RAF作為 ERK1／2通路的重要組成部分，其表達量的變化對OA起重要作用。本研究所用U0126為MEK特異性抑制劑，通過調(diào)控ERK1／2信號通路抑制TNF-α、IL-1β的表達，使MMPS和ADAMTS表達下降。本實驗結(jié)果顯示，補腎壯筋湯下調(diào)軟骨細胞炎癥模型 ADAMTS4、ADA－MTS5、MMP-3、MMP-13和RAF的表達，說明補腎壯筋湯可抑制炎癥介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡。

miR-140是miRNA家族成員之一，可調(diào)節(jié)軟骨細胞的功能，以維持軟骨基質(zhì)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。體外培養(yǎng)軟骨細胞，炎癥因子IL-1β高表達可抑制miR-140表達，而miR-140的高表達對IL-1β的產(chǎn)生有下調(diào)效果［16］，說明二者存在著相互作用的關(guān)系。此外，miR-140還能負向調(diào)控MMP-13、MMP-3的表達，miR-140表達的降低，MMP-13、MMP-3的表達會升高進而加快蛋白多糖和Ⅱ型膠原的降解［16］。本研究顯示，補腎壯筋湯組miR-140表達顯著升高，提示補腎壯筋湯通過上調(diào)miR-140表達，抑制炎癥反應(yīng)介導(dǎo)軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，但miR-140與炎癥因子的具體調(diào)節(jié)機制有待深入研究。

補腎壯筋湯中化合物具有良好的多樣性，既含有類藥性質(zhì)，又是天然產(chǎn)物化合物的一個特殊子集，提示其成分的多樣性和復(fù)雜性，本研究僅僅初步探討miR-140是補腎壯筋湯調(diào)控軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的重要靶點，而其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待于今后的深入研究。