潘夏薇 賴穎真 許銘炎

1. 361000, 廈門醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系; 2. 廈門醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院

基金項目： 2015 年福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(編號： 2015-ZQN-ZD-35)； 廈門醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)基金(編號： K2015-06)

整合素αvβ6對調(diào)節(jié)細胞間或者細胞和細胞外基質(zhì)(ECM)附著力,粘附固定細胞，促進信號通路等[1]，起著重要的作用。殼聚糖(chitosan)是一種帶高正電荷的天然高分子多糖，可與帶負電荷的基因、生長因子、抗腫瘤藥物等結(jié)合形成納米粒子[2]。金納米粒子(GNPs)因其良好的化學(xué)穩(wěn)定性及與蛋白質(zhì)、DNA和RNA有著良好的生物相容性,在抗原中是最常用的[3]。本實驗將研究制備Ch-GNPs聚合物，以殼聚糖金納米粒子為載體搭載質(zhì)粒pcDNA-β6，形成Ch-GNPs/β6復(fù)合物，分析其在小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1細胞中的轉(zhuǎn)染能力。為后期在鈦種植體表面構(gòu)建生物涂層做前期準備和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基本材料

殼聚糖-10、 HAuCl4·3H2O、 硼氫化鈉(Sigma Aldrich， 美國)； pcDNA-β6、 X-gal、 NP40、 EDTA, 胰蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑、 anti-β-Gal(CST， 美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ch-GNPs溶液的制備 將殼聚糖溶于0.1 mol/L的HCL中，配置出質(zhì)量體積分數(shù)為0.33%的殼聚糖溶液。取1 ml新鮮配制的10 mmol/L的HAuCl4溶液，加入2 ml 0.33%的殼聚糖溶液中，攪拌1 h。 取0.1 mol/L新鮮配制的冰冷的冰硼氫化鈉溶液0.4 ml快速添加到溶液中，不斷攪拌。溶液迅速變成酒紅色。置于超速離心機在4 ℃， 35 000 g 運轉(zhuǎn)30 min收集Ch-GNPs沉淀。將收集的Ch-GNPs加入超純水后配制成50 mg/ml的濃度，做進一步的鑒定和實驗[4]。通過紫外可見吸收光譜和TEM對Ch-GNP的大小和形狀進行評估。

1.2.2 Ch-GNPs/DNA復(fù)合物的制備 將5、 10、 15和20 μg的 Ch-GNPs溶液(50 mg/ml)與5 μg的pcDNAβ6(150 μg/ml) 混合形成比例分別是1∶1, 2∶1, 3∶1和4∶1的Ch-GNPs/DNA復(fù)合物， Control為純DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳帶分析Ch-GNPs/DNA的最優(yōu)結(jié)合比率。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將原代小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1，用α-MEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS， 100 U/ml青霉素， 100 μg/ml鏈霉素)，在37 ℃下、 5% CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.4 免疫印跡 使用改良的裂解緩沖液(150 mmol/L NaCl， 50 mmol/L pH8的Tri-HCl， 1% NP40， 5 mmol/L EDTA， 1 mmol/L胰蛋白酶抑制劑, 0.1 mmol/L亮抑蛋白酶肽和 1 mmol/L胃蛋白酶抑制劑)裂解細胞, 收集細胞，提取蛋白后依次經(jīng)10% SDS-凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育、化學(xué)增強發(fā)光系統(tǒng)檢測免疫條帶。

1.2.5 X-gal半乳糖苷酶染色 轉(zhuǎn)染前24 h， 以每孔4×104的密度接種到24 孔板。設(shè)置對照組，A組為未加入Ch-GNPs/DNA的空白組， B組加入比例為1∶1的Ch-GNPs/DNA， C組加入比例為2∶1的Ch-GNPs/DNA組。轉(zhuǎn)染時，將24 孔板中按標準培養(yǎng)條件下生長的轉(zhuǎn)染細胞，用含2%(V/V)甲醛, 0.2%(V/V)戊二醛的1×PBS溶液固定1 h后, 用PBS溶液清洗3 次， 使用X-gal染色溶液 (含2 mmol/L X-gal, 2 mmol/L K3Fe(CN)6、 2 mmol/L K4Fe(CN)6、 2 mmol/L MgCL2、 1×PBS)在37 ℃下染色24 h。使用立體顯微鏡對轉(zhuǎn)染細胞進行觀察并存儲數(shù)字圖像。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

Ch-GNPs溶液紫外可見吸收峰集中在520 nm, 這是Ch-GNPs典型的表面等離子體共振吸收峰 (圖 1)。 TEM圖像顯示Ch-GNPs表現(xiàn)出均勻、分散的粒度分布，粒子呈球形，平均直徑10～20 nm(圖 2)。

2.2 Ch-GNPs/DNA復(fù)合物

4 個不同濃度Ch-GNPs/DNA加樣孔由于DNA和Ch-GNPs之間靜電力吸引力以至于DNA無法遷移，仍位于凝膠加樣孔中。通過比較DNA的亮度分析結(jié)果(圖 3)。

圖 1 紫外可見分光光度計測得吸收峰

圖 2 透射電鏡下觀察Ch-GNPs，粒子直徑10～20 nm

(×25 000)

圖 3 不同比例的Ch-GNPs/pcDNA在電泳下所見的條帶

圖 4 用免疫印跡檢測不同比例的Ch-GNPs/DNA的基因蛋白表達

2.3 WB

WB顯示了β-gal的高水平表達(圖 4)。 在2∶1比例下的Ch-GNPs/DNA的基因蛋白表達最強， 也說明該比例的復(fù)合物能被MC3T3-E1細胞內(nèi)吞進細胞表達基因蛋白。

2.4 X-gal染色

轉(zhuǎn)染后，一部分細胞在X-gal染色下變藍可證實基因的表達。Ch-GNPs和DNA比例為2∶1的復(fù)合物與比例為1∶1的復(fù)合物相比，轉(zhuǎn)染能力有所提高，可達到75%(圖 5)。

3 討 論

本實驗中利用殼聚糖的優(yōu)勢還原金離子和穩(wěn)定金納米粒子，過程簡單,不會引起任何環(huán)境毒性或生物危害，在紫外線光譜和TEM實驗中進一步證實了Ch-GNPs的形成。 研究證明Ch-GNPs的大小和形態(tài)對于細胞的有效吸收是非常重要的。Ch-GNPs表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi),形成Ch-GNPs/DNA復(fù)合體。納米粒子粒徑在100 nm以下能夠很好的承載DNA基因通過內(nèi)吞作用進入細胞或胞飲，保證細胞對粒子的內(nèi)吞[5]。粒徑越小，包封率和載藥量也越高，同時其副反應(yīng)也越小[6]。

A: 未加入Ch-GNPs/DNA的空白組; B: 比例為1∶1的Ch-GNPs/DNA組; C: 比例為2∶1的Ch-GNPs/DNA組

圖 5 X-gal染色檢測Ch-GNPs/DNA在MC3T3-E1細胞中的轉(zhuǎn)染

(×40)

瓊脂糖凝膠電泳實驗確定了Ch-GNPs/pcDNA復(fù)合物的結(jié)合能力,同時隨著Ch-GNPs濃度的增加，DNA的濃度也隨之顯著減少，表明更高濃度的納米粒子并不會破壞質(zhì)粒DNA復(fù)合體。WB結(jié)果顯示在2∶1比例下的Ch-GNPs/pcDNA的基因蛋白表達最強，證實了Ch-GNPs和DNA能夠有效的結(jié)合，以Ch-GNPs為載體，可廣泛的在體內(nèi)和體外傳遞有效的DNA，從而達到基因治療的目的。

X-Gal是β-半乳糖苷酶的顯色底物，在其催化下水解產(chǎn)生藍色產(chǎn)物5-溴-4-淀藍，通過顏色變化可大致判斷出酶活性，快速辨識并進行量化[7]。結(jié)果表明Ch-GNPs/DNA復(fù)合物進入細胞,引發(fā)β-半乳糖苷酶的表達。證實了Ch-GNPs/ cDNA可以攜帶報告基因進入MC3T3-E1細胞。意味著納米粒子一方面可能會在基因傳遞中增加質(zhì)粒DNA的生物利用度,另一方面，殼聚糖鏈上的胺組在酸性溶液中帶正電荷,與帶負電荷的DNA結(jié)合，形成帶正電的納米顆粒，也大大保護了DNA免受核酸酶的降解。

因此，Ch-GNPs可以作為基因載體攜帶質(zhì)粒進行基因治療的實驗研究，為后期在鈦表面涂層研究對成骨細胞的增殖和分化奠定基礎(chǔ)。