崔宇平 馬洪 段曉峰 孫昆俊

口腔癌是世界第六大癌癥，全球平均每年臨床上確診的發(fā)病人數(shù)約500 000 人，癌癥晚期的患者存活率低(5 年生存率大約10%～30%)[1-2]，在我國， 每10 萬名癌癥患者中罹患口腔癌疾病率為男性8.7/10 萬， 女性6.0/10 萬，相關(guān)研究表明，口腔癌的發(fā)生與發(fā)展是多基因疾病、環(huán)境及遺傳因素共同參與的結(jié)果[3-7]。近年來相關(guān)臨床研究表明，細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)基因在乳腺癌、卵巢癌、直腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)。本次研究通過Real Time PCR技術(shù)檢測(cè)CCNB1 mRNA分別在正常口腔黏膜組織及口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中的表達(dá)情況，并比較其在OSCC中不同的臨床特征是否有表達(dá)差異，為OSCC的早期發(fā)現(xiàn)及診斷提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

標(biāo)本來自貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及貴州省腫瘤醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的新鮮組織(患者年齡≥18 歲)，患者術(shù)前檢查均無全身系統(tǒng)性疾病;正?？谇火つそM織取自拔牙患者;所有42 例OSCC組織及17 例正常組織,離體后立即用RNA later液暫封, 4 ℃冰箱過夜，-80°C冰箱保存。收集時(shí)間 2016-06～2017-01。

1.2 引物合成

根據(jù)參考文獻(xiàn)確定內(nèi)參基因序列及引物[8]。CCNB1，上游序列：catggtgcactttcctcctt；下游序列：aggtaatgttgtagagttggtgtcc。內(nèi)參基因GAPDH，上游序列：cttagcacccctggccaag；下游序列:gatgttctggagagccccg。

1.3 主要試劑及Real-time PCR技術(shù)

切取2～3 mm3大小組織, 利用Dynabeads?Rm-RNA DIRECTTM試劑盒(Roche公司,美國)， 使用磁珠法提取組織中mRNA, 用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Roche公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。再用LightCycler?R480 SYBR Green I Master(Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增,采用10 μl反應(yīng) 體系: SYBR Green I Master 5 μl, 上下游引物4.0 μl, 模板1 μl。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃, 1 min;變性95 ℃, 10 s; 退火65 ℃, 30 s, 共64 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品7 個(gè)復(fù)孔,取CT平均值,采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料數(shù)據(jù), 應(yīng)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

結(jié)果表明, 42 例OSCC及17 例口腔正常黏膜組織相對(duì)表達(dá)量分別為: (1.336 0±0.675 9), (0.035 9±0.023 8),t=12.446,P<0.05。其中OSCC組織中,不同臨床特征間比較結(jié)果(表 1)所示，CCNB1 mRNA擴(kuò)增曲線為比較經(jīng)典的S型(圖 1)，大約在21 個(gè)循環(huán)后進(jìn)入熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， 大約擴(kuò)增12 個(gè)循環(huán)以后進(jìn)入平臺(tái)期，從擴(kuò)增曲線我們可以了解到，CCNB1的CT值平均為21左右，CCNB1 mRNA溶解曲線為一個(gè)單峰(圖 2)，此單峰前后均未見其它的峰值，均可說明在實(shí)驗(yàn)過程中未見因?qū)嶒?yàn)操作不當(dāng)可能引起的污染。

表 1 CCNB1 mRNA在OSCC中不同臨床特征的相對(duì)表達(dá)量

Tab 1 The relative expression of CCNB1 mRNA in OSCC different clinical features

臨床特征nCCNB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量t值P值性別 男181.496 1±0.656 41.3420.187 女241.216 0±0.678 9年齡(歲) <60201.322 7±0.721 30.1210.905 ≥60221.348 2±0.648 8分化狀態(tài) 高分化271.139 1±0.691 82.7250.009 中、低分化151.690 5±0.489 7臨床分期 Ⅰ Ⅱ241.018 7±0.645 24.1500.000 Ⅲ Ⅳ181.759 1±0.455 0

注：P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖 1 CCNB1 RT-PCR擴(kuò)增曲線

圖 2 CCNB1 RT-PCR溶解曲線

3 討 論

細(xì)胞周期蛋白首先在海膽受精卵中被發(fā)現(xiàn)，在Howard學(xué)說中，細(xì)胞周期的各個(gè)分期是以細(xì)胞核DNA的復(fù)制和分裂作為標(biāo)準(zhǔn)，分成G1期(合成前期)、S期(合成期)、G2期(合成后期)、M期(分裂期)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，從細(xì)胞的G1～G2期均為細(xì)胞間期，細(xì)胞周期蛋白在有絲分裂的細(xì)胞間期開始進(jìn)行合成，其含量在G2/M期含量達(dá)到峰值，隨后含量逐漸減低直至下一輪細(xì)胞周期開始進(jìn)行重復(fù)，不同類型的細(xì)胞周期蛋白與相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)互相作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖與發(fā)展。

CCNB1是細(xì)胞周期蛋白(cyclin)家族成員之一，該基因的長度大約8 800 bp，其作用于真核細(xì)胞有絲分裂周期中的G2/M檢測(cè)點(diǎn)，CCNB1是CDC2蛋白(cell division cycle 2)的伴侶分子，隨著CCNB1的含量與活性的增高，CDC2也會(huì)隨之增高，CCNB1與CDC2互相結(jié)合形成M期促進(jìn)因子(M phase-promoting factor， MPF)，使細(xì)胞從細(xì)胞間期向M期進(jìn)行轉(zhuǎn)變并開始有絲分裂，進(jìn)而促進(jìn)真核細(xì)胞周期的發(fā)展[9]，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期中期以后，后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)將泛素與CCNB1相連接，這時(shí)蛋白酶體(proteasome)將發(fā)揮作用，對(duì)結(jié)合泛素的CCNB1進(jìn)行識(shí)別然后對(duì)其進(jìn)行降解，進(jìn)一步使MPF失活[10]，當(dāng)MPF失活以后也就意味著M期的結(jié)束，一個(gè)完整的細(xì)胞周期完成，當(dāng)CCNB1表達(dá)失調(diào)時(shí)，例如本次研究結(jié)果所示，在OSCC中CCNB1的表達(dá)量增高，使細(xì)胞G2/M檢測(cè)點(diǎn)受損以及導(dǎo)致MPF的增高，該檢測(cè)點(diǎn)無法檢測(cè)DNA是否損傷，這就會(huì)使受到損傷的DNA繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的有絲分裂，還會(huì)導(dǎo)致在分裂期的中期蛋白酶體無法分解和識(shí)別全部的MPF，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的不斷增殖與發(fā)展[11]，然而在正常細(xì)胞周期中，如果有損傷或者非正常的DNA，G2/M期的所合成的MPF活性和相對(duì)應(yīng)的表達(dá)含量會(huì)受到抑制，使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期造成一定的阻礙作用，從而抑制了細(xì)胞的發(fā)展與增殖，相對(duì)應(yīng)的就是CCNB1 mRNA的表達(dá)量相對(duì)較小，與本次的研究結(jié)果相一致。

本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，CCNB1 mRNA在OSCC中高表達(dá)，在性別和年齡的分組中，鱗狀細(xì)胞癌組織中男性的CCNB1 mRNA的表達(dá)以及大于60 歲的年齡組雖然相比于女性和小于60 歲的年齡組有差異性，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)無意義，說明CCNB1的表達(dá)量可能不受到由于年齡或性別原因?qū)е麦w內(nèi)激素等水平的改變而增加或減小表達(dá)量，然而在病理分級(jí)和臨床分期分組來比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)有意義，隨著OSCC分化程度越低，CCNB1 mRNA的表達(dá)量就越高，OSCC的臨床分期越晚，CCNB1 mRNA的表達(dá)量也會(huì)隨之增高，這兩組比較結(jié)果可能說明在OSCC細(xì)胞在發(fā)展過程中，CCNB1與鱗狀細(xì)胞起到相輔相成的作用，使癌細(xì)胞進(jìn)一步增殖和分化，同樣更多的癌細(xì)胞又促使CCNB1的表達(dá)量進(jìn)一步升高，其結(jié)果在對(duì)乳腺癌[12]、結(jié)腸癌[13]、垂體腺瘤[14]、肝癌[15]中CCNB1 mRNA呈高表達(dá)具有一致性?？梢酝茰y(cè)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，CCNB1的表達(dá)含量增高，與CDC2結(jié)合后形成MPF，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)MPF過度累積以及基因檢測(cè)點(diǎn)的受損，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞生成、增殖與分化，并且與腫瘤的惡性程度及臨床分期有相輔相成的關(guān)系。

綜上所述，CCNB1在OSCC中高表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)量與分化狀態(tài)和腫瘤細(xì)胞的臨床分期及分化狀態(tài)有一定的關(guān)系，提示在腫瘤細(xì)胞中惡性程度越高，臨床分期越晚，其表達(dá)量越高，對(duì)于此次研究，未來有望通過調(diào)節(jié)CCNB1的表達(dá)量或從不同角度對(duì)該基因的靶向治療來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為口腔惡性腫瘤的靶向治療提供一個(gè)良好的靶點(diǎn)，或者對(duì)于CCNB1的促進(jìn)因素也同樣可以用各種途徑進(jìn)行抑制，最終的目的都是盡可能的降低CCNB1的表達(dá)量促使降低MPF的形成，從分子水平對(duì)口腔惡性腫瘤及預(yù)后有一個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)。