王璐 張洲銘 金諾 蔡卜磊 董廣毅 李德超

通過組織工程骨進(jìn)行牙槽骨的修復(fù)再生實(shí)質(zhì)是由再生與血管化2 個(gè)方向共同調(diào)節(jié)的。在此期間，如果血管再生不充分會(huì)導(dǎo)致新生組織內(nèi)部營養(yǎng)缺乏，從而導(dǎo)致組織吸收甚至感染[1]。尤其是當(dāng)缺損面積較大或組織再生能力差時(shí)，組織中新血管的形成和穩(wěn)定更加重要。

血管網(wǎng)絡(luò)的建立需要多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),如血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)，血管生成素(Angiopoietin-1，Ang-1)等[2-3]。通過聯(lián)合使用多個(gè)生長因子可以在一定程度上促進(jìn)組織內(nèi)的血管再生，但是這種外源性直接干預(yù)會(huì)打破血管重建平衡從而導(dǎo)致大量不成熟的血管形成而造成血管高壓進(jìn)一步發(fā)生血管微滲漏[4-5]。miRNA長約21～23 個(gè)核苷酸，是一種內(nèi)源性產(chǎn)生的單鏈非編碼RNA分子，具有高度的保守性和高組織表達(dá)特異性。miRNA的過度表達(dá)或抑制可同時(shí)調(diào)節(jié)多種生長因子的內(nèi)源性表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)某些miRNA可以通過間接誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種血管生成相關(guān)因子來促進(jìn)血管的形成和成熟[6]，為組織工程材料內(nèi)部血管化提供了新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級4～6 周齡C57 裸鼠，雄性，體質(zhì)量 18～25 g[空軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院(原第四軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心]。

1.2 主要試劑與儀器

α-MEM(12561-056， Gibco，美國)； 胎牛血清、 2.5 g/L胰酶細(xì)胞消化液(Hyclone公司， 美國)； E.Z.N.A.?Total RNA Kit I(OMEGA公司，美國)； Prime ScriptTMRT-PCR Kit、 SYBR?Premix Ex TaqTM(Takara公司， 日本)； Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR(廣東Ruibo 公司)； pEGFP-N1-miR126、 lipofectamine 3000 Transfection Kit(L3000-001， Invitrogen公司， 美國)；PVDF(500-600， BIO-RAD， 美國)； G418(Sigma公司， 美國)；CD31(abcam公司， 美國)； Matrigel(Corning公司，美國)；超凈工作臺(tái)(Forma公司，美國)； CO2恒溫孵育箱、 酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司，美國)； 共聚焦熒光顯微鏡 (Olympus Optical公司，日本)； Real-time RT-PCR 儀(Applied Biosystems公司, 美國)。

1.3 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilical vein endothelial cells, HUVECs)的分離和培養(yǎng)

無菌條件收集采自空軍軍醫(yī)大學(xué)(原第四軍醫(yī)大學(xué))西京醫(yī)院婦產(chǎn)科新生兒臍帶(本研究得到西京醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并取得了產(chǎn)婦的知情同意)，將取來的臍帶立即移入超凈工作臺(tái)，在無菌條件下，吸取無菌生理鹽水從臍帶一端插入臍靜脈沖洗至沖洗清亮，注入胰蛋白酶消化數(shù)分鐘，消化完畢后，松開固定端，將消化液收集到盛有10% α-MEM培養(yǎng)基的15 ml離心管中，吹打均勻后1 500 r/min離心5 min，棄上清；接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞傳代至第3 代用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞miRNA的轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期為第3 代的HUVEC，按照 lipofectamine 3000 Transfection Kit說明書進(jìn)行操作。將HUVEC細(xì)胞以1×106個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于六孔板中；miR-126序列如下：5′-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3′，同時(shí)設(shè)置對照序列。轉(zhuǎn)染72 h后開始用400 μg/ml的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每3 天換液1 次， 1 周后更換為200 μg/ml的G418選擇培養(yǎng)液篩選6 周后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 miRNA轉(zhuǎn)染效率和效果驗(yàn)證

1.5.1 熒光半定量觀察 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h之后，用PBS沖洗2～3 次，4%多聚甲醛固定1 h， PBS洗滌2～3 次，用DAPI室溫染色，吸除染色液，PBS洗滌2～3 次，抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察紅色熒光顯色情況，鏡下計(jì)數(shù)10 個(gè)40 倍視野發(fā)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分率作為轉(zhuǎn)染效率的近似值。

1.5.2 miRNA表達(dá)的檢測 轉(zhuǎn)染24 h后按照E.Z.N.A.?Total RNA Kit I說明書分組提取細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀檢測RNA濃度，每個(gè)標(biāo)本抽取等量的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測提按照Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件： 37 ℃、 15 min； 85 ℃、5 s；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?Rt-PRC 反應(yīng)條件： 95 ℃、 10 min； 95 ℃、 2 s； 60 ℃、 20 s； 70 ℃、 10 s； 40 個(gè)循環(huán)。

1.6 miRNA成血管相關(guān)基因和蛋白的檢測

1.6.1 RT-PCR 檢測 通過 RT-PCR方法檢測miR-126表達(dá)的變化對成血管相關(guān)基因Vegf 和 Ang1的表達(dá)的影響。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件： 37 ℃、 15 min； 85 ℃、 5 s； -20 ℃保存?zhèn)溆?。Rt-PRC 反應(yīng)條件： 95 ℃、 30 min； 95 ℃、 5 s， 60 ℃、 34 s， 95 ℃、 15 s， 60 ℃、 1 min、 95 ℃、 15 s； 40 個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參。各組引物由Takara生物科技公司合成，各引物序列(表 1)。

表 1 RT-PCR引物及其序列

Tab 1 RT-PCR primers and their sequences

1.6.2 Western blot蛋白印跡檢測 通過Western blot蛋白印跡方法檢測miR-126對成血管相關(guān)蛋白Vegf、 Ang1的表達(dá)的影響，將HUVEC接種在6 孔板中，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，轉(zhuǎn)染步驟同上， 24 h后檢測，按照說明書MinuteTMTotal Protein Extraction Kit(Invent公司， 美國)進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取。轉(zhuǎn)染后 37 ℃、 5% CO2孵箱至第14 天，裂解細(xì)胞，按照BCA法測量蛋白濃度，上樣。通過 SDS-PAGE 凝膠電泳，安裝電泳槽及電源，PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，孵育一抗， 4 ℃過夜，1%TBST洗滌3 次每次5 min，室溫孵育二抗， 1 h后1% TBST洗滌3 次每次5 min后使用 Thermo 公司發(fā)光液、顯影。以下是使用的抗體稀釋比例: Vegf 1∶500， Ang-1 1∶500， β-acting 1∶1 000。 IMAGE-J軟件分析條帶的灰度值。

1.7 Matrigel成管實(shí)驗(yàn)

將 Matrigel 預(yù)先放置于4 ℃冰箱過夜，溶膠，實(shí)驗(yàn)開始前將接觸到Matrigel槍頭、離心管、 96 孔板、培養(yǎng)液等均放在4 ℃冰箱預(yù)冷，取出 Matrigel移至超凈臺(tái)內(nèi)在冰上操作，混勻Matrigel基質(zhì)，按每孔吸取 10 μl 加入96 孔板中， 37 ℃孵育45 min， 將轉(zhuǎn)染miR-126和miR-NC的HUVEC胰蛋白酶消化2 min， 離心5 min， PBS清洗2 遍， 用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度每孔按1×105個(gè)細(xì)胞接種，放回孵箱培養(yǎng)24 h，后激光共聚焦觀察成管效果。

1.8 細(xì)胞免疫熒光染色

CD31對成管進(jìn)行染色，PBS清洗細(xì)胞2 次， 4%多聚甲醛固定1 h， 用含0.2%Tritonx-100的PBS透化5 min， 含3%FBS的PBS清洗細(xì)胞3 次， 含3% FBS和0.5% Teween20封閉1 h， 一抗(CD31按1∶500稀釋)室溫封閉1 h， PBS清洗細(xì)胞3 次， 熒光二抗(1∶500稀釋)室溫孵育30 min， PBS清洗3 次，防熒光催化劑封片，后激光共聚焦觀察成管效果。

1.9 體內(nèi)血管形成實(shí)驗(yàn)

將Matrigel 預(yù)先置于4 ℃冰箱過夜，溶膠400 μl，將107個(gè)細(xì)胞(miR-126與miR-NC轉(zhuǎn)染后)混勻于膠中(全程冰上操作)。將裸鼠麻醉后，無菌條件下，老鼠背部皮下注射400 μl基質(zhì)膠細(xì)胞混合物， 7 d后取材， 10%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、烤片； CD31免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-126 過表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

通過激光共聚焦結(jié)合real time RT-PCR 分析比較miRNA轉(zhuǎn)染效率與效果(圖 1A)。 miR-126轉(zhuǎn)染(圖 1B)HUVEC后RT-PCR結(jié)果顯示， miR-126/HUVEC組與miR-NC/HUVEC組(1.00±0.1)相比較， miR-126相對表達(dá)水平為(7.88±1.1)， miR-126/HUVEC組miR-126表達(dá)量顯著高于miR-NC/HUVEC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A: 激光共聚焦顯微鏡觀察(×200)； B： miR-126在HUVECs內(nèi)的表達(dá)(n=3)

圖 1 miR-126在HUVECs中的轉(zhuǎn)染效率

A: Laser confocal microscopy observation(×200); B: miR-126 expression in HUVECs(n=3)

Fig 1 miR-126 transfection efficiency into HUVECs

2.2 miR-126促進(jìn)HUVEC成血管關(guān)鍵生長因子的表達(dá)

通過real time RT-PCR 和Western blot 比較分析成血管相關(guān)基因的表達(dá)， miR-126轉(zhuǎn)染HUVEC后RT-PCR結(jié)果顯示，miR-126過表達(dá)有效的促進(jìn)了胞內(nèi) VEGF；ANG-1的RNA(圖 2A)和蛋白(圖 2B)的表達(dá)。

2.3 miR-126促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成

體外Matrigel 管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-126/HUVEC 組有明顯的環(huán)形管狀似血管結(jié)構(gòu)，端端可見接觸，管壁形態(tài)完整，miR-NC/HUVEC組未見明顯端端接觸和環(huán)形管狀結(jié)構(gòu)且管狀結(jié)構(gòu)不完整(圖 3)。

2.4 miR-126體內(nèi)促進(jìn)了血管化

基于體內(nèi)異位成血管的模型，通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31免疫熒光染色顯示，miR-126在HUVEC的過表達(dá)有效的促進(jìn)了其在體內(nèi)的血管再生。miR-126/HUVEC組中 CD31陽性細(xì)胞含量明顯高于miR-NC/HUVEC 組，說明miR-126能夠有效促進(jìn)體內(nèi)微血管的形成(圖 4)。

3 討 論

局部微血管的新生對于牙槽骨缺損的再生修復(fù)具有重要意義，穩(wěn)定新血管的生成需要血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子b(TGF-b)和血管生成素1(Ang1)等關(guān)鍵生長因子[7-9]，但因子遞送方式和時(shí)間是刺激新生血管形成和成熟的關(guān)鍵[10]。盡管遞送生長因子可以促進(jìn)血管生成，但過量遞送單一生長因子所生成的血管通常都是不成熟血管和，極易發(fā)生微滲漏。因此，新生血管的成熟穩(wěn)定需要多個(gè)生長因子作用并同時(shí)嚴(yán)格控制遞送生長因子的劑量。

圖 2 VEGF和ANG-1 mRNA在HUVECs中的表達(dá)

Fig 2 The expression of mRNA and protein of VEGF and ANG-1 in HUVECs

圖 3 HUVECs的管腔形成(n=3)

(×50)

Fig 3 Lumen formation of HUVECs

(×50)

圖 4 HUVECs 體內(nèi)血管化(綠色： CD31； 藍(lán)色： DAPI)

(×200)

Fig 4 The vascularization of HUVECsinvivo(Green: CD31; Blue: DAPI)

(×200)

miRNA可以同時(shí)靶向多個(gè)mRNA[11-12]，過度表達(dá)或抑制多個(gè)特定miRNA，從而同時(shí)調(diào)節(jié)多種生長因子的內(nèi)源性表達(dá)。在血管生物學(xué)領(lǐng)域中，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)可以調(diào)節(jié)血管生成的miRNA。據(jù)報(bào)道，miRNA如miR-93， miR-214及miR-221/22等能夠通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而促血管生成或抗血管生成[13]。又有研究表明腫瘤細(xì)胞中miR-21和miR-29b的過度表達(dá)通過上調(diào)血管生成生長因子如HIF-1a和VEGF來誘導(dǎo)血管生成[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)中敲除miR-126-3后，細(xì)胞內(nèi)PIK3R2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)逆轉(zhuǎn)、血管生成素-1(Ang-1)誘導(dǎo)的Akt活化和BMEC凋亡的抑制[15-17]。而本研究發(fā)現(xiàn)HUVEC轉(zhuǎn)染miR-126后可顯著提高成血管相關(guān)基因VEGF和Ang1的表達(dá)，而且體外成管實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)miR-126的過表達(dá)可促進(jìn)血管的形成并且提高血管完整性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-126的過表達(dá)明顯促進(jìn)了體內(nèi)血管網(wǎng)的形成以及成熟。

近年來，組織工程骨在牙槽骨缺損的治療中取得了重大突破，但組織工程骨內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)建立仍是大范圍骨缺損修復(fù)的難點(diǎn)所在。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-126能夠同時(shí)促進(jìn)成多種血管相關(guān)基因的表達(dá)與分泌，進(jìn)而促進(jìn)血管的再生和成熟，為組織工程骨內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)建立提供了新的治療策略。