李雪健 王忠山 劉茜 馮曉珂 劉歡 寧瀟 趙銥民

成體干細(xì)胞用于人類某些疾病的研究進(jìn)展迅速，如利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療活動(dòng)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已被用于臨床，其安全性和有效性已得到證實(shí)[1]，將人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，PDLSCs)應(yīng)用于牙周缺損的基礎(chǔ)和臨床研究也越來(lái)越多。以往大量研究表明[2]，釉基質(zhì)衍生物在牙齒以礦化發(fā)育過(guò)程中起到重要作用，且具有較強(qiáng)的促進(jìn)牙周膜的再生以及誘導(dǎo)無(wú)細(xì)胞牙骨質(zhì)形成的能力，而且這種再生形式與組織在胚胎期的原始發(fā)育過(guò)程類似。在本研究中，首先制備脫礦牙本質(zhì)支架(treated dentin matrix，TDM)，然后加載不同濃度釉基質(zhì)衍生物(enamel matrix derivative, EMD)，研究其對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的黏附、增殖、細(xì)胞伸展的影響以及分化誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

α-MEM培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶(Hyclone, 美國(guó))； I型膠原酶(Gibco，美國(guó))；EDTA溶液胎牛血清(BI，以色列)；CCK-8試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)；低速金剛石切割機(jī)(沈陽(yáng)科晶自動(dòng)化設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(tái)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；CO2細(xì)胞孵育箱(Thermo Forma, 美國(guó))；釉基質(zhì)衍生物(Straumann, 瑞士)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；掃描電子顯微鏡(日立，日本)；離心機(jī)、反轉(zhuǎn)錄PCR儀(Eppendorf, 德國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量分析儀(Bio-rad, 美國(guó))。

1.2 PDLSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

經(jīng)患者或其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后，收集18～25 周歲年齡段患者的因正畸需要拔除的前磨牙或埋伏阻生的第三磨牙。無(wú)菌環(huán)境下，將牙根中1/3處的牙周膜用無(wú)菌手術(shù)刀片刮下，剪成體積約1 mm3的組織碎片，移至15 ml離心管內(nèi)，加入濃度為0.2%的I型膠原酶溶液，于37 ℃環(huán)境下消化45 min， 其間每隔15 min搖勻1 次，消化后的組織碎片用2 ml α-MEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS, 1%雙抗)種入六孔板內(nèi)，移入細(xì)胞孵育箱，在37 ℃、 5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，采用有限稀釋克隆法獲取3～5 代PDLSCs用于以下實(shí)驗(yàn)備用。

成骨誘導(dǎo)：取第3 代PDLSCs細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%融合時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)液(含10% FBS、 1.8 mmol/L KH2PO4、 10 nmol/L地塞米松和50 μg/mL抗壞血酸的α-MEM培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)， 3 周后茜素紅染色。

成脂誘導(dǎo)：取第3 代PDLSCs細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%融合時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)液(含10% FBS、100 nmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMT、 10 μg/ml胰島素和50 mmol/L吲哚美辛的α-MEM培養(yǎng)基)進(jìn)行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)， 2 周后油紅O染色。

1.3 脫礦牙本質(zhì)支架的制備及鑒定

用低速金剛石切割機(jī)將所收集離體牙的牙冠部分切割成厚度約1 mm的薄片，利用高速牙科渦輪手機(jī)磨除外圍牙釉質(zhì)，然后分別用0.2、 0.25、 0.5 mol/L的EDTA溶液依次脫礦5 min，每換一次脫礦液用無(wú)菌PBS超聲清洗3 次，每次清洗5 min，超凈臺(tái)中吹風(fēng)干燥，紫外線照射過(guò)夜，掃描電鏡觀察其表面形態(tài)。

1.4 脫礦牙本質(zhì)支架上釉基質(zhì)衍生物的加載

首先采用0.1%乙酸溶液溶解一整支EMD-gel,然后將其進(jìn)一步溶解到α-MEM培養(yǎng)基，配制成0、 50、 100 μg/ml不同EMD濃度的溶液。在無(wú)菌操作臺(tái)中將24 孔板各孔分為3 組，每組5 孔，每組每孔內(nèi)分別加入1 ml 不同濃度的EMD溶液，將脫礦牙本質(zhì)支架置于不同分組，并浸泡48 h后取出，凍干，真空干燥后噴金，掃描電鏡下觀察其表面形態(tài)。

1.5 支架上PLDSCs增殖能力檢測(cè)

將加載不同濃度EMD的TDM支架置于48 孔板，每組濃度設(shè)3 孔，將第4 代PDLSCs以3×103個(gè)/孔接種在復(fù)合支架上，分別加入含0、 50、 100 μg/ml EMD溶液，利用CCK-8試劑盒測(cè)量細(xì)胞增殖曲線。

1.6 支架上PLDSCs黏附以及細(xì)胞伸展能力觀察

將第4代PDLSCs以1.5×104個(gè)/cm3的密度接種于0、 50、 100 μg/ml EMD溶液復(fù)合TDM支架上，將每組細(xì)胞分別在接種后第30、 60、 120 min用4%多聚甲醛溶液固定15 min，無(wú)菌PBS緩沖液清洗，采用DAPI染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)每組細(xì)胞的密度，利用鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架伸展情況。

1.7 支架上PLDSCs成骨及成牙骨質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

將第4代PDLSCs接種于0、 50、 100 μg/ml EMD溶液復(fù)合TDM支架上，分別在第3 天和第7 天收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，RNA質(zhì)檢合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA, RT-qPCR法檢測(cè)2 組細(xì)胞在2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)OCN、ALP、RUNX2、CAP、CEMP-1基因的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表 1，引物由均北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)目的基因表達(dá)量。

表 1 基因引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 3 組比較采用方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs的培養(yǎng)與鑒定

PDLSCs為長(zhǎng)梭型，呈集落樣生長(zhǎng)(圖 1A、1B)。成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色后，倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)橘紅色鈣化結(jié)節(jié)形成(圖 1C)；成脂誘導(dǎo)14 d后，油紅O染色后可見(jiàn)紅色脂滴(圖 1D)，證明成功培養(yǎng)出具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2 TDM支架掃面電鏡結(jié)果

切割后的牙本質(zhì)片未脫礦前可見(jiàn)明顯的玷污層，表面粗糙，遮蓋了牙本質(zhì)小管(圖 2)，EDTA溶液脫礦后，玷污層被去除，充分暴露牙本質(zhì)小管，表面相對(duì)光滑(圖 2)。

2.3 EMD復(fù)合TDM支架掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡下觀(圖 3)TDM支架上有大量不規(guī)則球狀蛋白聚合物平鋪于表面，部分進(jìn)入牙本質(zhì)小管內(nèi)，直徑約為1～10 μm，其密度隨加載EMD的濃度0、 50、 100 μg/ml依次增加，說(shuō)明EMD溶液中的各種蛋白能夠沉積到牙本質(zhì)表面并且進(jìn)入牙本質(zhì)小管發(fā)揮作用。

2.4 TDM支架對(duì)PLDSCs增殖的影響

CCK-8測(cè)定的細(xì)胞增殖曲線(圖 4)顯示，不同濃度EMD改性的TDM支架對(duì)PDLSCs的增殖有不同的促進(jìn)作用，且存在一定的劑量依賴效應(yīng)。

2.5 TDM支架上PLDSCs黏附伸展能力

細(xì)胞黏附結(jié)果(圖 5～6)顯示，第30、 60、 120 min，不同組復(fù)合支架上黏附的細(xì)胞的數(shù)目不同，且隨EMD濃度數(shù)值的增加而升高。且在120 min， 相比對(duì)照組， 50、 100 μg/ml EMD組的PDLSCs出現(xiàn)了更多的細(xì)胞突，伸展程度更明顯(圖 7)，說(shuō)明EMD改性的TDM支架對(duì)PLDSCs的黏附伸展均有促進(jìn)作用。

圖 1 PDLSCs形態(tài)與鑒定

(倒置顯微鏡，×40)

A: Cultured P0 PDLSCs; B: Cultured P3 PDLSCs; C: Alizarin red staining; D: Oil red O staining

Fig 1 Characterization of PDLSCs

(Inverted microscope, ×40)

圖 2 牙本質(zhì)片表面形態(tài)(SEM， ×5 000) 圖 3 EMD復(fù)合TDM支架表面形態(tài)

(SEM， ×5 000)

Fig 2 Surface morphology of dentin matrix Fig 3 Surface morphology of EMD treated TDM

(SEM, ×5 000) (SEM, ×5 000)

圖 4 PDLSCs增殖曲線

2.6 TDM支架對(duì)PLDSCs成骨及成牙骨質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

加載EMD后，在第3 天，CAP、CEMP-1成牙骨質(zhì)相關(guān)基因，OCN、ALP、RUNX2成骨相關(guān)基因均呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)(圖 8)；在第7 天， 除早期表達(dá)的ALP外，其他結(jié)果與第3 天相似，提示EMD改性的TDM支架對(duì)PLDSCs成骨及成牙骨質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)有促進(jìn)作用。

圖 5 PDLSCs接種60 min后DAPI染色熒光顯微鏡下觀

(×100)

Fig 5 PDLSCs stained with DAPI under a fluorescence microscope after 60 min of incubation

(×100)

圖 6 細(xì)胞數(shù)量對(duì)比

圖 7 PDLSCs接種120 min后鬼筆環(huán)肽染色熒光顯微鏡下觀

(×100)

Fig 7 PDLSCs stained with phalloidin under a fluorescence microscope after 120 min of incubation

(×100)

圖 8 PDLSCs基因表達(dá)

3 討 論

釉基質(zhì)衍生物的來(lái)源為牙齒發(fā)育期的成釉上皮細(xì)胞以及Hertwig 氏上皮根鞘的內(nèi)層細(xì)胞，其主要成分包括釉原蛋白(amelogenin)，釉蛋白(enamelin)、成釉蛋白(ameloblastin)、釉成熟蛋白(amelotin)和硫化釉蛋白(sulfated enamel proteins)以及一些蛋白酶類[3]。其中釉原蛋白占主要蛋白成分的90%以上，它們可以自組裝成超分子聚合物，形成不溶的細(xì)胞外基質(zhì)，來(lái)控制釉質(zhì)晶體發(fā)生過(guò)程中的超微結(jié)構(gòu)的形成[4]?；A(chǔ)研究表明， 釉基質(zhì)衍生物可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖和遷移能力[5]，減少細(xì)菌的數(shù)量[6-7]，從而減弱機(jī)體的炎癥狀態(tài)；應(yīng)用釉基質(zhì)衍生物后，微血管細(xì)胞的分化及組織再血管化得到促進(jìn)，表明其在創(chuàng)傷愈合中的軟組織再生中可以發(fā)揮一定作用[8-9]。以釉基質(zhì)衍生物為主要成分的商品試劑Emdogain?[10]已在其他國(guó)家被廣泛應(yīng)用于牙周缺損治療的各類牙周手術(shù)中，其安全性與有效性已得到證實(shí)，對(duì)牙周組織創(chuàng)傷愈合以及牙周軟硬組織的再生均有促進(jìn)作用，但釉基質(zhì)衍生物與人牙周膜干細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

脫礦牙本質(zhì)支架來(lái)源于人不再行使功能的牙齒，如因正畸需要拔除的前磨牙或埋伏阻生的第三磨牙，然后通過(guò)切割、沖洗、脫礦等工序制備而成。TDM內(nèi)富含骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，BMP對(duì)血管周的間質(zhì)干細(xì)胞有成骨和成軟骨向的誘導(dǎo)分化作用[11]，TDM有一定的誘導(dǎo)骨形成作用，是一種很好的骨移植材料。在體外實(shí)驗(yàn)中，TDM也是模擬體內(nèi)牙本質(zhì)暴露環(huán)境的最佳選擇。

本研究首次將釉基質(zhì)衍生物加載于脫礦牙本質(zhì)支架上，成功制備了EMD改性的牙本質(zhì)支架，并對(duì)其表面形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)EMD能夠沉積于牙本質(zhì)表面，且進(jìn)入牙本質(zhì)小管發(fā)揮作用。探究改性后的牙本質(zhì)支架對(duì)牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)作用結(jié)果顯示，其對(duì)PDLSCs的黏附、伸展、增殖均有促進(jìn)作用，且存在一定的濃度依賴效應(yīng)，此結(jié)果對(duì)于再生醫(yī)學(xué)中，組織形成的基礎(chǔ)，種子細(xì)胞的生存有著很明顯的意義。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平研究表明，EMD改性后的牙本質(zhì)支架對(duì)PDLSCs內(nèi)成骨及成牙骨質(zhì)向分化的相關(guān)基因的表達(dá)均有促進(jìn)作用。

牙周再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，牙槽骨再生[12]、牙周纖維的再生已有大量研究和進(jìn)展，但牙骨質(zhì)的再生一直是世界性的難題，導(dǎo)致很多的牙周缺損治療效果不佳，釉基質(zhì)衍生物聯(lián)合人牙周膜干細(xì)胞共同作用有望成為實(shí)現(xiàn)牙骨質(zhì)再生，治療牙周缺損的有效方法。本研究用EMD加載于牙本質(zhì)支架上，與臨床貼近，進(jìn)一步模擬了臨床牙周病患者牙本質(zhì)暴露的環(huán)境，在此基礎(chǔ)之上，其對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)作用的意義更加深遠(yuǎn)。