楊金泉，賀小敏，施敏芳，朱友林

1.湖北省環(huán)境監(jiān)測中心站， 湖北 武漢 430072 2.長江大學， 湖北 武漢 430000

性激素是一種由動物體性腺所產(chǎn)生或由人工合成的分子量低、親脂性、具有生物活性的類固醇類物質(zhì)[1]，主要包括雄激素、雌激素和孕激素。由于性激素有促進性器官成熟、副性征發(fā)育、縮短動物生長周期及維持性功能等作用，在醫(yī)療、養(yǎng)殖及化妝品生產(chǎn)等領域具有廣泛應用。環(huán)境水體中性激素類污染物主要來源于人體和牲畜的排泄物、養(yǎng)殖業(yè)和化妝品生產(chǎn)廢水排放等。性激素一般性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，且是一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，一旦進入人或動物體內(nèi)，可模擬、干擾人類或動物體正常分泌物的合成、運輸和釋放，使人類或動物無法正常維持自身的平衡，引發(fā)畸形、變態(tài)、神經(jīng)行為異常及兒童性早熟等疾病，即使在極低的環(huán)境濃度(ng/L級)下也會對生物體產(chǎn)生巨大的內(nèi)分泌干擾效應[2]。因此，快速篩查和檢測環(huán)境中的性激素類污染物具有重要意義。

性激素在水環(huán)境中濃度較低，直接進樣時往往無法達到儀器的測定下限，通常采用固相萃取(SPE)[3-4]、固相微萃取(SPME)[5]、分散液液微萃取(DLLME)[6]等預處理方法進行富集，再通過液相色譜[7]、液質(zhì)聯(lián)用[1,3-5]和氣質(zhì)聯(lián)用[8]等儀器進行檢測。由于液質(zhì)聯(lián)用技術具有高通量、高選擇性、高靈敏度，定性準確，無需繁瑣的衍生化等優(yōu)點，成為檢測分析性激素類污染物的較優(yōu)選擇。目前，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定性激素的方法很多，但主要集中在對食品、化妝品及生物組織的檢測中[7,9-10]，水環(huán)境中性激素類污染物的研究報道較少，且大多數(shù)僅對一種激素或一類激素進行測定[3-4,11]。

本文建立了同時測定地表水中5種雌激素(雌酮、β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、己烯雌酚)、3種雄激素(睪酮、群勃龍、康力龍)及1種孕激素(孕酮)的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(SPE-UPLC-MS/MS)，同時對前處理條件、色譜和質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化研究，最后對湖北省7處地表水中性激素展開了應用分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器設備：超高效液相色譜儀Agilent 1290(美國安捷倫公司)；三重四極桿質(zhì)譜儀Agilent 6460(美國安捷倫公司)，配置電噴霧電離源(ESI)；Agilent ZORBAX Extend-C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國安捷倫公司)；VisiprepTMDL 12孔固相萃取裝置(配有真空泵和虹吸管，美國SUPELCO公司)；親水親脂平衡型(HLB)固相萃取柱(500 mg/6 mL，美國Waters公司)；TurboVap LV氮吹儀(美國Biotage公司)；0.22 μm微孔濾膜。

9種性激素標準樣品：雌酮(G131869，2017-03-06)，β-雌二醇(121727，2016-11-11)，雌三醇(108035，2016-05-31)，己烯雌酚(G128192，2017-01-19)，睪酮(50214，2015-08-10)，群勃龍(146883，2017-07-04)，康力龍(125992，2016-12-14),孕酮(101203,2016-03-17)(以上物質(zhì)的純度均大于95%，由德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn))；17α-乙炔雌二醇(BCBS8539V,2017-09-28，純度>98%，美國Sigma Alorich公司)。2種性激素內(nèi)標：雌二醇-d3(170121，2017-01-21)，睪酮-d3(170427，2017-04-27)(以上物質(zhì)的濃度均為100 μg/mL，溶劑為甲醇，由德國Manhage公司生產(chǎn))。甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；氟化銨(色譜純，美國Fluka公司)；水為Milli-Q超純水；高純氮氣99.999%。

1.2 標準溶液的配制

單個性激素標準儲備溶液的配制：以甲醇為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的9種目標化合物標準儲備溶液，4 ℃避光保存。

單個內(nèi)標儲備溶液的配制：以甲醇為溶劑分別配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的2種內(nèi)標化合物標準儲備溶液，4 ℃避光保存。

混合內(nèi)標工作溶液的配制：準確移取1 mL內(nèi)標儲備溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成混合內(nèi)標中間液10 mg/L，再以甲醇水溶液(體積比為1∶1)配制成1 mg/L混合內(nèi)標使用液，4 ℃避光保存。

混合標準工作溶液的配制：分別準確移取1 mL各化合物標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成混合標準中間液10 mg/L，再以甲醇水溶液(體積比為1∶1)配制成1 mg/L混合標準使用液，分別準確移取0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL于10 mL容量瓶中，再加入0.5 mL濃度為1 mg/L混合內(nèi)標使用液，用甲醇水溶液(體積比為1∶1)稀釋為混合標準工作溶液(濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L)，4 ℃避光保存。

將上述單個標準儲備液和內(nèi)標儲備液分別用甲醇稀釋為100 mg/L的標準中間液，再以甲醇水溶液(體積比為1∶1)稀釋為1 mg/L，用于優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。

1.3 樣品采集和保存

2018年1月，在武漢(3個水廠)、黃石(1個水廠)、孝感(1個水廠)、鄂州(1個湖泊)、咸寧(1個水庫)等7處共設置16個監(jiān)測點位。水廠監(jiān)測點位設置在取水口；水庫和湖泊監(jiān)測點位設置在入水口、出水口、中心及周邊可能的污染源附近。樣品采集和保存參照《水質(zhì) 樣品的保存和管理技術規(guī)定》(HJ 493—2009)和《水質(zhì) 采樣技術指導》(HJ 494—2009)，使用預先洗凈烘干的棕色玻璃瓶保存樣品，避光于4 ℃以下冷藏，在10 d內(nèi)萃取，萃取后的樣品應于4 ℃避光冷藏。

1.4 樣品前處理

活化小柱：依次用10 mL甲醇和10 mL超純水活化HLB固相萃取小柱，活化過程中注意保持柱頭濕潤。

富集淋洗：量取500 ml水樣于燒杯中，用1 mol/L NaOH和HCl水溶液(體積比為1∶1)將水樣調(diào)節(jié)至pH=7，以3～5 mL/min的流速通過活化后的小柱，再用10 mL 10%甲醇水溶液淋洗固相萃取小柱后繼續(xù)抽吸1 h。

洗脫濃縮：用10 mL純甲醇以1 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，于37 ℃恒溫水浴并用氮氣濃縮至0.5 mL，然后以超純水定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后加入50 μg/L混合內(nèi)標工作溶液，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

在分析樣品的同時作全程序空白實驗，即按照上述實驗過程以超純水代替水樣完成全部分析流程，檢查分析過程中是否存在污染。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 色譜條件

流動相為1 mmol/L氟化銨水溶液(A)和乙腈(B),流速為0.3 mL/min，進樣量10 μL，柱溫為30 ℃。流動相梯度洗脫程序：0～2 min(70%A+30%B)；2～4 min，(70%A+30%B)→(40%A+60%B)；4～10 min，(40%A+60%B)→(10%A+90%B)；10～13 min，(10%A+90%B)；13.1 min，(70%A+30%B)，然后運行3 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，監(jiān)測模式為多反應監(jiān)測(MRM)模式，離子源溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣流速11 L/min，霧化器壓力3.1×105Pa，毛細管電壓3 500 V。質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式參數(shù),見表1。

表1 9種性激素的質(zhì)譜參數(shù)和保留時間Table 1 MS/MS parameters and retention times of the 9 hormones

注：“*”為內(nèi)標物；“**”為定量離子。

2 結果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

分別將濃度為1 mg/L 9種性激素標準溶液直接注入質(zhì)譜儀，進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。先通過全掃描模式確定化合物的母離子和正負離子采集模式，再作選擇離子監(jiān)測模式優(yōu)化其碎裂電壓及毛細管電壓使母離子的響應最大，然后對母離子作子離子全掃描，獲得碎片離子信息，選擇豐度較高的2個特征碎片離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化碰撞能量使其響應最大，最后得到該化合物的2個MRM離子對及相應的質(zhì)譜參數(shù)(表1)。

根據(jù)實驗，雌激素類化合物采用負離子模式采集時響應較高，而雄激素、孕激素則宜采用正離子模式采集。這主要是由于雌激素類化合物含有酚羥基，易失去1個H+產(chǎn)生[M-H]-母離子，即負離子模式(ESI-)；雄激素、孕激素則因含有羰基等多電子基團而易得到1個H+形成[M+H]+母離子，即正離子模式(ESI+)。

2.1.2 流動相的優(yōu)化

由于3類性激素結構和性質(zhì)差別較大，要實現(xiàn)3類激素同時測定，還要兼顧靈敏度和重現(xiàn)性。實驗考察了各目標化合物在酸性、中性、堿性及不同緩沖鹽流動相條件下的分離情況。因甲酸、氨水、醋酸銨、氟化銨等化合物揮發(fā)性較強，不易在色譜柱和質(zhì)譜中殘留，實驗主要采用這幾種化合物來調(diào)節(jié)流動相pH和離子強度，對比了不同濃度的氨水-乙腈、水-乙腈、甲酸-乙腈、醋酸銨-乙腈、氟化銨-乙腈等作為流動相時，9種性激素的出峰情況。結果表明，雌激素在氟化銨-乙腈條件下響應值最高，峰形最好，而其他激素在醋酸銨-乙腈和氟化銨-乙腈條件下較好，因此選擇氟化銨-乙腈作為分離條件。

因為氟化銨有一定的腐蝕性，濃度過大可能對色譜柱有一定的損害，實驗考察了低濃度(0.5、1、2 mmol/L)氟化銨-乙腈為流動相時，9種性激素的響應值和峰形。結果顯示，隨著氟化銨濃度增大，雌激素響應值有所增加，2 mmol/L氟化銨與1 mmol/L氟化銨雌激素響應情況相當，最終確定1 mmol/L氟化銨水溶液-乙腈為流動相。性激素標準溶液的MRM色譜圖，見圖1。

圖1 9種性激素標準溶液的多反應監(jiān)測模式色譜圖Fig.1 Multi-reaction monitoring chromatograms for the 9 hormones in a standard solution

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

由于9種目標性激素均為弱極性化合物，宜采用反相固相萃取柱進行富集。比較了常用的2種反相固相萃取小柱C18和HLB柱對性激素的回收率情況，結果見圖2?？梢姡珻18小柱對各性激素的保留能力一般，回收率為53%～78%，而HLB小柱對各目標物的保留能力相對較好，回收率為75%～103%。這可能是由于某些性激素化合物極性偏強，具有一定的水溶性，而C18小柱主要對極性偏弱的化合物保留效果好；HLB小柱中的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，與C18小柱不同，HLB小柱是一種復合模式的吸附劑，即可通過疏水作用與性激素分子發(fā)生作用，也可通過親水作用對性激素進行保留。同時，HLB小柱的比表面積也大于C18小柱，這更加有利于保留目標化合物。

圖2 不同固相萃取柱對性激素回收率的比較Fig.2 Comparison of recoveries for the 9 hormones at different SPE column

2.2.2 水樣pH的優(yōu)化

因性激素分子大部分含有酚羥基，在不同pH下發(fā)生不同程度的電離，實驗考察了水樣在不同pH(3、4、5、6、7、8)條件下，9種性激素的回收率情況，結果如圖3所示。在酸性條件下(pH<7)，雌激素和群勃龍回收率均低于10%，其他3種性激素回收率為50%～85%。隨著pH的增大，各目標物富集效率提高，至pH=7時各性激素回收率達到最高，但當pH繼續(xù)增大至堿性條件時，各目標物富集效果又有所下降。這可能是由于在酸性或堿性條件下，各類激素均有不同程度的電離，極性增大，在HLB小柱上的保留能力下降；而在中性條件下，各目標物呈分子形態(tài)，極性最小，在HLB填料內(nèi)保留情況最好。

圖3 不同pH水樣對性激素回收率的影響Fig.3 Effects of different pH on recoveries for the 9 hormones

2.2.3 淋洗液的選擇

為了去除基質(zhì)干擾，可在洗脫前對固相萃取小柱進行淋洗，通常在淋洗液中添加一定比例的甲醇，能明顯去除色素等干擾物質(zhì)，但同時也會造成目標化合物的損失[11]?？疾炝瞬煌壤?5%、10%、15%、20%)的甲醇水溶液作為淋洗液時，樣品基質(zhì)去除情況及回收率情況。結果表明，當甲醇比例為10%時，各目標物回收率為75%～113%，而當甲醇比例增加至15%時，部分性激素回收率下降較多，回收率僅為62%～91%。因此，在保證回收率的同時，最大程度去除基質(zhì)干擾，應選擇10%的甲醇水溶液為淋洗液。

2.2.4 洗脫液和體積的選擇

由于性激素具有一定的極性，實驗比較了甲醇和乙腈對性激素的洗脫情況。結果發(fā)現(xiàn)，兩者洗脫效果相當，而乙腈沸點高(甲醇沸點64.7 ℃，乙腈沸點81.6 ℃)，濃縮時間長，因此選擇甲醇為洗脫劑?？疾觳煌w積的甲醇對9種性激素的洗脫情況，繪制各化合物的流出曲線(圖4)。由圖4可見，大部分目標化合物在洗脫體積為5 mL時回收率已趨于穩(wěn)定，而康力龍、雌酮在洗脫體積達到10 mL時回收率才達到最大，為保證各目標物均能被完全洗脫，方法最終選擇洗脫劑用量為10 mL。

2.3 線性關系、精密度、準確度和檢出限

用甲醇水溶液(體積比為1∶1)配制成不同濃度梯度的目標化合物混合工作溶液，考察線性范圍、相關系數(shù)等指標(表2)?？梢?，除了17α-乙炔雌二醇外，其他目標化合物在1～200 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均超過0.998。

將9種低濃度性激素標準樣品添加至超純水中(雌激素10 ng/L，其他2 ng/L)，按照上述條件進行前處理，平行測定7份樣品，按照3.143倍標準偏差獲得各目標化合物的方法檢出限。如表2所示，9種性激素的方法檢出限為0.1～1.8 ng/L。

表2 9種性激素的標準曲線和方法檢出限Table 2 The standard curves and detection limits of the 9 hormones

注：“a、d”取樣量為500 mL，定容至1 mL；“b、c”取樣量為1 L，定容至1 mL；“—”表示未檢測該物質(zhì)。

按上述優(yōu)化的方法進行目標化合物的加標回收率實驗，在純水中加入低、中、高3種濃度水平的性激素標準樣品，使雄、孕激素的終濃度為10、100、200 ng/L，雌激素的終濃度為40、200、400 ng/L，每種濃度水平設置3個平行樣，計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表3?？梢姡瑢τ诟鳚舛人降募訕思兯畼悠?，除17α-乙炔雌二醇略偏低外，純水中其他性激素的加標回收率均為71.9%～115.0%，RSD均為3.2%～17.7%。此外，實驗還對實際水樣進行了基體加標實驗，選擇不同類型的地表水樣品，包括河流、水庫、湖泊等水樣，每種類型的水樣選擇3個不同點位的樣品，加入性激素標準樣品，使其終濃度均為50 ng/L，9種性激素的加標回收率為65.8%～119.4%。

表3 9種性激素的加標回收率和相對標準偏差Table 3 The RSD and recoveries of the 9 hormones

注：“ND”表示檢測結果低于方法檢出限；“—”表示未檢測該物質(zhì)。

由表2、表3可見，與已有的報道相比較，本研究方法檢出限較低，其值略高于文獻[12]，但低于文獻[3]、文獻[11]的報道，能夠滿足地表水中性激素的分析測定要求；純水和實際水樣中性激素的加標回收率范圍與已有文獻報道相當，表明本方法準確度較好，適合于地表水樣的分析測定。

2.4 實際樣品的分析

采用上述建立的SPE-UPLC-MS/MS檢測方法，對湖北省7處地表水共16個點位水樣中9種性激素進行了分析，其中7個點位有不同程度的性激素檢出，其余9個點位均未檢出，結果見表4。在有檢出的7個點位水樣中，主要有雌三醇、17α-乙炔雌二醇，檢出的濃度分別為2.0～23.0、3.8～11.4 ng/L；雌酮、群勃龍和孕酮也有少量檢出，檢出濃度均低于1.7 ng/L。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究地表水樣中雌三醇和17α-乙炔雌二醇的濃度范圍與已有文獻報道基本一致，但其最大檢出濃度略高于文獻[13]報道，而雌酮、群勃龍、孕酮的最大檢出濃度均低于文獻[13]、文獻[14]報道的水平。

表4 9種性激素的實際樣品分析結果Table 4 Analytical results of the 9 hormones in samples ng/L

注：“ND”表示檢測結果低于方法檢出限；“*”表示(濃度±標準偏差)ng/L(n=3)；“—”表示未檢測該物質(zhì)。

3 結論

采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了地表水中9種性激素殘留量的檢測方法，實現(xiàn)了9種性激素的快速分離和痕量分析。對湖北省內(nèi)7處地表水樣進行性激素含量測定的結果表明，該方法操作簡單高效，定性準確，精密度好，靈敏度高，具有一定的可推廣性。