李碩 李曉慧 黎百志 嚴(yán)亞琪 董文超 單偉超 劉超 王鵬飛 丁振江王瑞鵑

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院本部心臟內(nèi)科（河北承德067000）

慢性心力衰竭是導(dǎo)致患者死亡的一個(gè)非常重要的原因［1-3］，是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末階段，形勢(shì)尤為嚴(yán)峻。心室重塑、心肌能量代謝障礙、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等多種機(jī)制共同作用引起慢性心力衰竭，其中心肌細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)導(dǎo)致以線粒體為靶點(diǎn)的漸進(jìn)性細(xì)胞改變，誘發(fā)線粒體凋亡通路，進(jìn)而引發(fā)慢性心力衰竭的病理過(guò)程是重要的機(jī)制之一［4-5］。

心臟是個(gè)高耗能器官，正常的心肌細(xì)胞需要不斷地合成ATP 從而提供充足的能量，進(jìn)而維持心臟正常的細(xì)胞活力和泵功能。線粒體占心肌細(xì)胞總體積的30%，能夠?yàn)樾呐K提供大約90%的能量，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用。因此，一旦線粒體功能障礙必然會(huì)影響心肌細(xì)胞的功能［6］。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）位于人和小鼠10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂21 區(qū)上，長(zhǎng)度為10～25 kb，是一種對(duì)DNA 有高親和力的高遷移率（HMG）蛋白，能夠通過(guò)與線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的LSP 和HSP 上游的識(shí)別位點(diǎn)的特異性結(jié)合來(lái)刺激轉(zhuǎn)錄［7］，是調(diào)控mtDNA 拷貝數(shù)和影響線粒體功能的重要轉(zhuǎn)錄因子［8］。小鼠模型中，TFAM 基因敲除導(dǎo)致mtDNA 拷貝數(shù)缺失及線粒體轉(zhuǎn)錄能力下降，進(jìn)而引起擴(kuò)張型心肌病。而TFAM 基因過(guò)表達(dá)能夠改善mtDNA拷貝數(shù)缺失，維持線粒體功能，抑制心肌細(xì)胞肥大，間質(zhì)纖維化及心肌凋亡［9］?；谶@些發(fā)現(xiàn)，筆者認(rèn)為TFAM 可能是慢性心力衰竭患者中線粒體功能障礙的線索。本研究通過(guò)利用RT-PCR 技術(shù)分析線粒體功能障礙的外周血細(xì)胞TFAM mRNA表達(dá)，闡明其與慢性心力衰竭的關(guān)系，評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)納入2017年8月至2018年8月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科住院的慢性心力衰竭患者63 例作為心衰組，其中男32 例，女31 例。根據(jù)患者既往是否患有冠心病史，分為缺血性心衰組33 例、非缺血性心衰組30 例。并依據(jù)美國(guó)紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將心衰患者分為NYHA Ⅱ級(jí)8 例、Ⅲ級(jí)16 例、Ⅳ級(jí)39 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：參考2014年中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南［10］。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有重度瓣膜病、肥厚或限制性心肌病、縮窄性心包炎、心源性休克、急性心肌梗死、嚴(yán)重肝功能不全［丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）或門冬氨酸基轉(zhuǎn)移酶（AST）＞5 倍正常上限］、嚴(yán)重腎功能不全（肌酐＞220 mmol/L）、各種惡性腫瘤、結(jié)締組織病、心肌炎、外傷、線粒體相關(guān)疾病、妊娠、哺乳。同期住院心功能正常患者94例作為對(duì)照組，其中男44 例，女50 例?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，并且本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 流行病學(xué)與臨床資料收集 記錄研究對(duì)象的資料：（1）一般資料：年齡、性別、身高、體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓、心率、體質(zhì)量指數(shù)、心功能分級(jí)、基礎(chǔ)疾病、既往病史、口服用藥等情況；（2）常規(guī)生化指標(biāo)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、肌酐（Cre）、尿酸、ALT、AST、腦鈉肽（BNP），采用我院生化室檢測(cè)值，日立全自動(dòng)7600 生化分析儀，試劑為中生公司有效期內(nèi)產(chǎn)品；（3）超聲心動(dòng)圖：由我院超聲科進(jìn)行檢查，收集左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室舒張末期前后徑（LVEDD）等數(shù)據(jù)。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血樣本 外周血采集：所有入選患者均在入院后于次日晨起靜臥1 h 后，采集2 mL外周靜脈血，用肝素鈉抗凝，混勻后置于2 mL EP管內(nèi)，標(biāo)記后放入實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)兩組外周血TFAM mRNA的表達(dá)水平 按照Qiagen 血液基因組RNA 提取試劑盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit）說(shuō)明書(shū)操作提取外周血總RNA，UV240 紫外分光光度儀讀取其OD260/OD280 的比值。cDNA 合成嚴(yán)格按照FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒（Fast Quant RT Kit）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，合成的cDNA 儲(chǔ)存在-20 ℃用于Combasz 480 實(shí)時(shí)PCR 定量。根據(jù)引物（由生工生物工程股份有限公司提供）設(shè)計(jì)的原則，TFAM上游引物：5′-GCATCTGGGTTCTGAGCTTT-3′，下游引物：5′-CCGAGGTGGTTTTCATCTGT-3′。管家基因上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，管家基因下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR 流程：PCR 溶液系統(tǒng)置于熒光PCR 儀行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：預(yù)熱95 ℃15 min ，變性、退火、延伸反復(fù)45 循環(huán)可擴(kuò)增得到大量位于兩條引物之間序列的DNA 片段。實(shí)驗(yàn)測(cè)得TFAM 的特異性擴(kuò)增曲線和溶解曲線。得到每個(gè)樣本的CT值，分別計(jì)算對(duì)照組目的基因和管家基因的平均CT 值，以此為參照，依據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本TFAM mRNA 的表達(dá)水平［11］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0 軟件包，計(jì)量資料：正態(tài)分布：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2 組間均數(shù)比較選擇t檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。偏態(tài)分布：四分位數(shù)表示，選擇秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料：例（%）表示，率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)。兩者間相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組一般資料比較：結(jié)果顯示兩組在性別、高血壓病史、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、飲酒史、ALT 方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組TFAM mRNA 表達(dá)（1.144±0.565）低于對(duì)照組（1.431 ± 0.868），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與非缺血性實(shí)驗(yàn)組（n=30）相比，缺血性實(shí)驗(yàn)組（n=33）年齡偏大［（72.606 ± 10.97）vs.（60.867±12.54），P＜0.05］、BNP較低［（1 184.57± 900.52）vs.（1 416.16 ± 852.662），P＜0.05）］、LVEF 較高［（46.12 ± 11.185）vs.（43.30 ± 15.257），P＜0.05］，TFAM mRNA 表達(dá)較高［（1.242 ± 0.526）vs.（1.036±0.594），P＜0.05］。見(jiàn)表1。

2.2 不同心功能NYHA分級(jí)組TFAM mRNA、BNP水平 不同心功能NYHA 分級(jí)組患者外周血BNP、TFAM mRNA 水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），外周血BNP 水平隨著NYHA 分級(jí)升高而升高，TFAM mRNA 表達(dá)隨著NYHA 分級(jí)升高而降低，見(jiàn)表2。

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data in groups ±s

表1 各組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data in groups ±s

注：與非缺血性心衰組相比，*P ＜0.05；與對(duì)照組相比，#P ＜0.05

臨床資料年齡（歲）男性［例（%）］高血壓?。劾?）］糖尿?。劾?）］吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）Cre（mmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）BNP（pg/mL）TFAMmRNA LVEF（%）LVEDD（mm）心衰組（n=63）63.36±9.51 32（50.79）38（60.32）27（42.86）#10（15.87）#15（23.81）23.28±3.587#133.23±23.06 82.75±15.27 3.86±1.055 1.34±0.682#98.58±52.194#43.97±69.666 40.259±72.351#1 294.85±878.755#1.144±0.565#44.778±13.246#57.762±12.721#缺血性心衰組（n=33）72.606±10.97*16（48.48）20（60.61）16（48.48）5（15.15）8（24.24）22.448±2.69 136.06±21.68 81.54±13.299 3.842±0.894 1.396±0.653 103.55±50.83 33.936±18.165 26.936±17.897 1 184.57±900.52*1.242±0.526*46.12±11.185*55.818±13.987非缺血性心衰組（n=30）60.867±12.54 16（53.33）18（60.00）11（36.67）5（16.67）7（23.33）24.196±4.220 130.13±24.46 84.06±17.314 3.874±1.224 1.281±0.721 93.11±53.98 55.073±98.850 54.913±102.048 1 416.16±852.662 1.036±0.594 43.30±15.257 59.900±11.002對(duì)照組（n=94）61.74±7.31 44（46.8）54（57.45）10（10.64）28（29.79）24（25.53）25.33±3.223 136.83±21.33 83.40±11.17 4.26±0.896 2.03±1.508 63.82±14.462 31.26±14.261 22.991±8.974 37.77±28.25 1.431±0.868 63.440±5.192 49.223±4.494

表2 心衰患者不同心功能分級(jí)組TFAM mRNA、BNP 水平Tab.2 TFAM mRNA and BNP levels in heart failure patients with different cardiac function grading groups ±s

表2 心衰患者不同心功能分級(jí)組TFAM mRNA、BNP 水平Tab.2 TFAM mRNA and BNP levels in heart failure patients with different cardiac function grading groups ±s

注：與NYHA 分級(jí)Ⅱ級(jí)組比較，*P＜0.05；與NYHA 分級(jí)Ⅲ級(jí)組比較，△P＜0.05

NYHA 分級(jí)ⅡⅢⅣ例數(shù)8 16 39 BNP 155.66±25.57 720.81±319.72*1 764.04±762.60△TFAM mRNA 1.91±0.178 1.48±0214*0.849±0.486△

2.3 不同LVEF、LVEDD 分組與TFAM mRNA水平 分別按LVEF 和LVEDD 進(jìn)行分組分析，研究表明LVEF ≤40%組外周血TFAM mRNA 水平低于LVEF＞40%組（P＜0.05）。LVEDD 50 ～70 mm組外周血TFAM mRNA 水平低于LVEDD ＜50 mm組（P＜0.05）；LVEDD ＞70 mm 組外周血TFAM mRNA 水平低于LVEDD ＜50 mm 組及LVEDD 50～70 mm 組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.4 TFAM mRNA 水平與不同變量的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示TFAM mRNA 水平與LVEF 呈正相關(guān)（r=0.429，P＜0.001），與LVEDD、BNP、糖尿病呈負(fù)相關(guān)（r=-0.277、-0.242、-0.173，P＜0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

慢性心力衰竭患者發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是當(dāng)今臨床研究中重要的課題之一［10］。近年來(lái)HUANG 等［12］研究表明，外周血mtDNA 拷貝數(shù)與慢性心力衰竭呈負(fù)相關(guān)，外周血mtDNA 拷貝數(shù)越低，慢性心力衰竭患者心功能越差。明確了mtDNA 與慢性心力衰竭之間具有相關(guān)性。但是TFAM mRNA 在慢性心力衰竭中的表達(dá)及作用尚未明確。本研究旨在通過(guò)橫斷面分析，探討慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表達(dá)，評(píng)估其臨床價(jià)值。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表達(dá)水平降低。同時(shí)隨著NHYA 分級(jí)升高，外周血TFAM mRNA 表達(dá)逐漸降低。

表3 心衰患者不同LVEF、LVEDD 分組TFAM mRNA 水平Tab.3 TFAM mRNA level in different LVEF and LVEDD groups of heart failure patients ±s

表3 心衰患者不同LVEF、LVEDD 分組TFAM mRNA 水平Tab.3 TFAM mRNA level in different LVEF and LVEDD groups of heart failure patients ±s

分組LVEF（%）＞40≤40 LVEDD（mm）＜50 50 ～70＞70例數(shù)TFAM mRNA 40 23 1.389±0.434 0.717±0.514*15 39 9 1.737±0.250 1.011±0.507△0.730±0.444#

表4 TFAM mRNA 水平與不同變量的相關(guān)性分析Tab.4 Analysis of correlation between TFAM mRNA level and different variables

TFAM 在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生，被轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體基質(zhì)，通過(guò)與mtDNA D 環(huán)內(nèi)的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而激活線粒體轉(zhuǎn)錄。在調(diào)控mtDNA 穩(wěn)定性、維持其完整性中起著關(guān)鍵性作用［13-15］。近年來(lái)，已有研究報(bào)道TFAM 作為線粒體核蛋白的主要蛋白，能夠保護(hù)線粒體免遭損傷，不僅因?yàn)榇罅看嬖诘腡FAM能夠包繞mtDNA 形成環(huán)狀球體，并能將數(shù)個(gè)球體壓縮形成類核從而減少ROS 的產(chǎn)生［16］，而且進(jìn)入線粒體內(nèi)的TFAM 還可以刺激抗氧化酶的產(chǎn)生，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶［17］，同時(shí)還可以抑制鈣離子通道，減少細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流［18］。TFAM 除了上述作用外，還參與多種疾病，如線粒體腦病、癌癥等。有較多關(guān)于TFAM 表達(dá)升高或降低參與這些疾病中的報(bào)道。NISHIO 等［19］研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞由于TFAM 與mtDNA 啟動(dòng)子結(jié)合活性的降低，導(dǎo)致線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激增加，從而使TFAM 表達(dá)下降。

本研究結(jié)果顯示慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 的表達(dá)降低，可能因?yàn)槁孕牧λソ咧?，線粒體內(nèi)通過(guò)電子傳遞鏈產(chǎn)生的ROS 增多，其能夠通過(guò)攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和mtDNA，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和/或死亡［20-21］，從而進(jìn)一步導(dǎo)致ROS 產(chǎn)生增加并形成mtDNA 損傷的惡性循環(huán)。研究［14，22-23］結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFAM 過(guò)表達(dá)能夠改善mtDNA 拷貝數(shù)缺失。因此，在心力衰竭初期，TFAM通過(guò)補(bǔ)償機(jī)制過(guò)量產(chǎn)生調(diào)控mtDNA 拷貝數(shù)，維持mtDNA 的完整性和穩(wěn)定性，這些反過(guò)來(lái)又有助于減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生［14］。但隨著心力衰竭程度逐漸加重大量產(chǎn)生ROS時(shí)，反而導(dǎo)致TFAM表達(dá)降低［24］。因此，慢性心力衰竭時(shí)TFAM mRNA表達(dá)下降。這一結(jié)果與心梗后心力衰竭小鼠模型中的研究結(jié)果相一致［25］。

此外，研究發(fā)現(xiàn)缺血性心肌細(xì)胞中TFAM表達(dá)水平下降，這與筆者既往所做的研究結(jié)論一致［26-27］。然而本研究結(jié)果顯示，與非缺血性實(shí)驗(yàn)組相比，缺血性實(shí)驗(yàn)組TFAM mRNA 表達(dá)較高，可能因?yàn)槿毖詫?shí)驗(yàn)組年齡偏大、BNP 較低、LVEF 較高，因此與非缺血性實(shí)驗(yàn)組相比，缺血性實(shí)驗(yàn)組中患者心功能嚴(yán)重程度較輕，從而有可能導(dǎo)致缺血性實(shí)驗(yàn)組中TFAM mRNA 表達(dá)較高。

端粒缺陷小鼠線粒體生物合成受損，包括mtDNA 含量下降，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如左室直徑增加、左室壁變薄、部分縮短減少。KNEZ等［28］的研究表明外周血mtDNA 含量與心臟結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，能夠作為左室直徑及體積重要預(yù)測(cè)因子。TFAM 作為mtDNA 的調(diào)控因子，其與心力衰竭中心臟結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)性研究已有報(bào)道。研究［29-30］顯示在組織特異性TFAM 敲除小鼠中，mtDNA 耗盡后呼吸鏈功能下降導(dǎo)致線粒體心肌病，其特點(diǎn)是左室擴(kuò)張和心肌重量增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著LVEF 減低、LVEDD 增大，TFAM mRNA 含量逐漸減少，TFAM mRNA 水平與LVEF 呈正相關(guān)，與LVEDD 呈負(fù)相關(guān)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上能夠說(shuō)明TFAM 與左室重構(gòu)有聯(lián)系［23］。值得注意的是，CHENG 等［31］研究發(fā)現(xiàn)中年時(shí)某些危險(xiǎn)因素的存在，包括高血壓和糖尿病，也與左室結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。因此，闡明TFAM 在左室重構(gòu)和功能障礙進(jìn)展到癥狀性心力衰竭中的作用需要進(jìn)一步的研究。

BNP 是心肌細(xì)胞分泌的一種激素［32］。BNP 水平與心力衰竭嚴(yán)重程度相關(guān)，是整個(gè)心力衰竭階段的預(yù)測(cè)因素［33］。本研究結(jié)果表明BNP 與TFAM mRNA 呈負(fù)相關(guān)，因此通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)BNP、TFAM mRNA 水平能夠更加準(zhǔn)確地診斷及評(píng)估心力衰竭，為臨床醫(yī)師提供更全面的診療信息。

本研究的局限性在于：本研究中樣本量偏小，使檢驗(yàn)效能減低。本研究是一個(gè)橫斷面研究，雖然本文的數(shù)據(jù)表明慢性心力衰竭患者外周血TFAM mRNA 表達(dá)下降，但是是由于外周血TFAM mRNA 表達(dá)下降導(dǎo)致慢性心力衰竭，還是慢性心力衰竭引起患者外周血TFAM mRNA 表達(dá)下降，目前尚未見(jiàn)明顯闡述，并且本研究對(duì)于藥物治療后沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步研究，針對(duì)治療后外周血TFAM mRNA 表達(dá)是否存在變化，需要進(jìn)行深入研究。

綜上所述，在慢性心力衰竭進(jìn)展過(guò)程中，外周血TFAM mRNA 表達(dá)進(jìn)行性下降，TFAM 在各種病因引起的心肌的病理變化中起著重要的作用，可能成為慢性心力衰竭的新型標(biāo)志物及治療的靶點(diǎn)。但慢性心力衰竭和TFAM 之間的因果關(guān)系還需進(jìn)一步研究。