李卓然 高詠璇 林楚瑩 秦琴保 梁廣鐵 闕志權(quán) 雷秀霞 江新青

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院1放射科，2檢驗(yàn)科，3老年病科（廣州510180）

近年心腦血管疾病已成為我國發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一［1］。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，各種先進(jìn)診療技術(shù)如電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）/核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以及分子診斷技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使心腦血管疾病的早期診療成為可能。研究［2］發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）會(huì)引起血管內(nèi)皮廣泛受損，血液雜質(zhì)容易沉積在血管內(nèi)而引起血管硬化及血管閉塞，從而誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生，是動(dòng)脈粥樣硬化與動(dòng)脈硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。相關(guān)研究結(jié)果［3］顯示：同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）每升高5 μmol/L 腦卒中風(fēng)險(xiǎn)升高59%，缺血性心臟病風(fēng)險(xiǎn)升高32%。體內(nèi)Hcy 濃度除了受葉酸及B 族維生素等的影響外，還受一些代謝酶遺傳多態(tài)性的限制，而亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy 代謝過程中最重要的調(diào)節(jié)酶，該基因的C677T 位點(diǎn)發(fā)生突變將會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)Hcy 水平增高從而誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生［4］。本研究擬對(duì)筆者醫(yī)院收治的部分老年心腦血管疾病患者顱腦部CT/MRI 影像學(xué)、頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（carotid intima-media thickness，IMT）的診斷結(jié)果及血漿Hcy 含量改變與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系作回顧性分析，旨在為臨床早期預(yù)測(cè)心腦血管疾病的發(fā)生及對(duì)不同基因型的人群進(jìn)行早期預(yù)防管理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年12月至2018年1月，在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院進(jìn)行MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)的年齡≥60 歲的老年住院患者864例，其中男525例，女339 例，年齡（79.47 ± 9.30）歲。在864 例患者中排除：（1）慢性腎功能不全患者、接受腎臟移植患者；（2）甲狀腺功能亢進(jìn)或甲狀腺功能減退患者；（3）急性肝功能受損患者；（4）惡性腫瘤患者；（5）近期服用甲氨蝶呤、茶堿、B 族維生素及葉酸患者后，被納入研究對(duì)象的患者共有294 例，均為年齡在65～89 歲范圍內(nèi)，無親緣關(guān)系的患者，采集并記錄其頸動(dòng)脈彩超影像、顱腦CT/MRI、冠心病病史等資料。本研究所涉及患者均已簽署知情同意書并符合倫理審核。

1.2 分組 根據(jù)1995年第4 屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)已行顱腦部CT/MRI 檢查的864 例老年患者結(jié)合臨床資料分為兩組：腦梗死組（n=468），其中男331 例，女137 例，年齡（82.49 ± 8.23）歲；非腦梗死組（n=396），其中男194 例，女202 例，年齡（75.90 ± 9.24）歲。294 例患者根據(jù)2012年美國心臟協(xié)會(huì)冠心?。╟oronary heart disease，CHD）診斷指南分CHD 組（n=96）與非CHD 組（n=198）；排除40 例所需研究資料不全的患者，根據(jù)顱腦部CT/MRI 分腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）LI 組（n=207）與非LI 組（n=47）；排除46 例無頸動(dòng)脈彩超資料的患者，根據(jù)MTHFR 基因多態(tài)性分為3 組：CC 組（n=99）、CT 組（n=87）、TT 組（n=62）。

1.3 研究方法

1.3.1MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè) 采集EDTA 抗凝血2 mL，然后進(jìn)行全血DNA 抽提—PCR 擴(kuò)增—雜交—掃片，記錄結(jié)果。MTHFR基因C677T 位點(diǎn)基因型分為：野生CC 型、雜合突變CT 型和純合突變TT 型。芯片試劑盒由上海BaiO 公司提供。

1.3.2 血漿Hcy 水平檢測(cè) 清晨空腹抽取靜脈血3～5 mL，4 000 r/min 離心5 min，采用AU5800全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，試劑由金斯?fàn)柟咎峁?/p>

1.3.3 顱腦部CT/MRI 檢查 CT檢查：采用Philips公司64 排螺旋CT 掃描機(jī)，掃描條件為120 kV，399 mAs，層厚、層間距均為5 mm，螺距為1.5 mm，F(xiàn)OV 為25.0 cm × 29.2 cm。常規(guī)平掃后，肘前靜脈注射對(duì)比劑行增強(qiáng)掃描，使用高壓注射器。顱腦CT 圖像見圖1。

圖1 顱腦CT 圖像Fig.1 Brain CT imaging pictures

MRI 檢查：采 用Philips Achieva1.5T MR 掃 描儀，采用常規(guī)自旋回波序列軸位T1W、T2W 和FLAIR序列。掃描參數(shù)：T1WI，TR 499 ms，TE 15 ms；T2WI，TR 3 567 ms，TE 100 ms；層厚6 mm，層間距0.5 mm，矩陣256×256。FLAIR序列，TR 6 000 ms，TE 120 ms。增強(qiáng)掃描參數(shù)同平掃T1WI，對(duì)比劑為Gd-DTPA，劑量0.1 mmol/kg 體質(zhì)量，采用高壓注射器自肘靜脈注射。顱腦MRI 圖像見圖2。

圖2 顱腦MRI 圖像Fig.2 Brain MRI imaging pictures

1.3.4 頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度測(cè)量方法及頸內(nèi)膜分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 專業(yè)醫(yī)師使用HP5500 彩色多普勒超聲儀（4～10 MHz 線陣式探頭），按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程測(cè)量頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度，通過測(cè)量血管內(nèi)中膜厚度、血管腔直徑以及觀察血流情況等，判斷頸動(dòng)脈血管狹窄程度，并參照2003年北美放射年會(huì)中超聲會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將頸動(dòng)脈內(nèi)膜分為0～5級(jí)。見圖3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料用百分比表示。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料的比較若分布符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法比較，相關(guān)性分析采用spearman 相關(guān)系數(shù)計(jì)算，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Hardy-Weinberg（HWE）平衡檢驗(yàn)進(jìn)行群體遺傳分析，P＞0.05為符合HWE。

圖3 頸動(dòng)脈內(nèi)膜0～5 級(jí)彩色多普勒超聲圖像Fig.3 Color doppler ultrasound image of carotid intima 0～5 level

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn) 864 例患者的基因檢測(cè)結(jié)果，通過卡方檢驗(yàn)計(jì)算實(shí)際基因型和理論基因型頻數(shù)間的差異，結(jié)果顯示3 種基因型符合遺傳平衡定律（P＞0.05），說明選取的研究對(duì)象具有群體代表性、恒定性。見表1。

表1 MTHFR 基因型Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)Tab.1 Hardy-Weinberg equilibrium test for MTHFR genotype

2.2 腦梗死組和非腦梗死組不同基因型占比比較 468 例腦梗死組患者CC 型、CT 型和TT 型3 種基因型所占百分率依次為43.38%、43.80%、12.82%；396 例非腦梗死組依次為56.82%、36.36%、6.82%，兩組患者各基因型經(jīng)Pearson 行列表卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.438，P＜0.001）。見表2。另外，將兩組患者中存在MTHFRC677T 位點(diǎn)突變的基因型（CT 型+ TT 型）和野生型（CC 型）進(jìn)行四格表卡方檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.505，P＜0.001）。

2.3 CHD 組與非CHD 組結(jié)果分析

2.3.1 CHD 組與非CHD 組的MTHFR基因型及等位基因分組結(jié)果比較 從各基因型的頻率分布來看，CHD 組與非CHD 組的MTHFRC677T 基因構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.187，P＜0.05）；前者的T/C 等位基因頻率（109%）明顯高于后者（66%）（χ2=8.129，P＜0.05）。見表3。

2.3.2 CHD 組與非CHD 組患者血漿Hcy 水平比較 CHD 組與非CHD 組患者兩組間血漿Hcy 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.496，P＞0.05）。兩組組內(nèi)TT 型患者的血漿Hcy 水平均顯著高于CC型（Z=-2.032，Z=-2.630；均P＜0.05）；而CT型患者與CC 型患者的血漿Hcy 水平比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.310，Z=-0.496；均P＞0.05），但CT型患者血漿Hcy水平高于CC型患者。見表4。

表2 腦梗塞組和非腦梗塞組的MTHFR 基因型分布Tab.2 Genotype frequency distribution of MTHFR genotype in cerebral infarction group and non-cerebral infarction group例（%）

2.4 LI 組與非LI 組結(jié)果分析

2.4.1 LI 組與非LI 組的MTHFR基因型及等位基因分組結(jié)果比較 從各基因型的頻率分布來看，LI組與非LI 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.967，P＜0.05）；前者的T/C 等位基因頻率（114%）明顯高于后者（54%）（χ2=12.449，P＜0.05）。見表3。

2.4.2 LI 組與非LI 組患者的血漿Hcy 水平比較 LI 組的血漿Hcy 水平與非LI 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.311，P＞0.05）。兩組組內(nèi)的各基因型組患者的血漿Hcy水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=183.338，χ2=138.872，均P＜0.05）；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)TT 型、CT 型患者的血漿Hcy 水平均顯著高于CC 型（Z=-12.841，Z=-5.694；Z=-3.326，Z=-3.976，均P＜0.05）。見表4。

表3 兩疾病組和對(duì)照組的MTHFR 基因型分布結(jié)果比較Tab.3 Genotype frequency distribution of MTHFR genotype in two diseases groups and control groups例

表4 兩疾病組和對(duì)照組的血漿Hcy 水平結(jié)果比較Tab.4 Comparison of plasma Hcy levels in two diseases groups and control groups ±s，μmol/L

表4 兩疾病組和對(duì)照組的血漿Hcy 水平結(jié)果比較Tab.4 Comparison of plasma Hcy levels in two diseases groups and control groups ±s，μmol/L

注：與TT 型經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，*P ＜0.05

組別血漿Hcy 水平CHD（n=294）CT 19.09±6.20 19.20±8.80 TT 21.17±10.16 21.15±7.94 CC 15.72±3.76*17.58±5.22*LI（n=254）CHD（n=96）非CHD（n=198）P 值LI 組（n=207）非LI 組（n=47）P 值總18.77±7.60 18.93±7.39＞0.05 18.57±6.93 17.54±6.80＞0.05 18.17±5.99 21.37±12.00 21.09±9.35*18.19±4.53*17.15±5.16*16.11±4.14*

2.5 不同基因型頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）及血漿Hcy 水平的比較 IMT 與血漿Hcy 水平的相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩者無明顯相關(guān)性（r2=0.016，P＞0.05）；各基因型組間的IMT 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.723，P＞0.05），另各基因型組間頸動(dòng)脈內(nèi)膜分級(jí)構(gòu)成差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.919，P＞0.05）。見表5。

各基因型組血漿Hcy 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.129，P＜0.05），TT 型患者血漿Hcy 水平顯著高于CC 型患者（Z=-3.206，P＜0.05），CT 型患者血漿Hcy 水平高于CC 型，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.276，P＞0.05）。見表6。

3 討論

人體正常生理狀態(tài)下空腹血漿Hcy 水平為5 ～15 μmol/L，當(dāng)空腹血漿Hcy 水平持續(xù)高于15 μmol/L時(shí)就稱為高同型半胱氨酸血癥（HHcy）。血漿中Hcy 濃度水平受遺傳因素、年齡、雌激素水平、營養(yǎng)狀況、藥物及疾病等多種因素影響［5］，其中，遺傳因素是影響HHcy 水平的重要因素，而MTHFR是Hcy 代謝最重要的調(diào)節(jié)酶，C677T 位點(diǎn)堿基純合突變可作為HHcy 一個(gè)重要的遺傳因素［6］。據(jù)文獻(xiàn)［7］報(bào)道：MTHFRC677T 的TT 型突變可使正常酶活性降低70%，從而顯著提高血漿內(nèi)Hcy 水平。本研究結(jié)果顯示，各心腦血管疾病組的突變純合子TT 基因型平均Hcy 水平均顯著高于野生CC 型，與以往研究報(bào)道一致［8］。說明TT 型基因突變確實(shí)會(huì)導(dǎo)致MTHFR 調(diào)節(jié)酶的活性減低。

表5 不同基因型頸動(dòng)脈內(nèi)膜分級(jí)情況的比較Tab.5 Comparison of carotid intima level in different genotype 例（%）

表6 不同基因型頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和血漿Hcy 水平的比較Tab.6 Comparison of carotid intima-media thickness,plasma Hcy levels in different genotype ±s

表6 不同基因型頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度和血漿Hcy 水平的比較Tab.6 Comparison of carotid intima-media thickness,plasma Hcy levels in different genotype ±s

注：與TT 型經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，*P ＜0.05

基因型CC（n=99）CT（n=87）TT（n=62）P 值頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（cm）0.120 6±0.008 9 0.118 4±0.009 4 0.123 8±0.030 0＞0.05血漿Hcy 水平（mmol/L）17.15±5.00*19.79±8.71 21.36±9.41＜0.05

冠心?。–HD）是指冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，是動(dòng)脈粥樣硬化致器官病變的最常見的類型。黃暉等［9］認(rèn)為血漿中Hcy 水平與冠狀動(dòng)脈病變的復(fù)雜程度密切相關(guān)，TANNE 等［10］研究發(fā)現(xiàn)血漿中高Hcy 水平與穩(wěn)定性冠心病患者發(fā)生缺血性事件的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；然而另一項(xiàng)Meta 分析［11］認(rèn)為血漿中Hcy 水平與CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)關(guān)系，用葉酸和維生素B12 治療并未發(fā)現(xiàn)可以降低心血管疾病高危人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，CHD 組血漿Hcy 濃度水平與非CHD 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在老年群體中，血漿Hcy 水平與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)未見直接相關(guān)關(guān)系。而WALD 等［12］從基因?qū)用嫜芯堪l(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T 基因突變純合子TT 基因型人群發(fā)生冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高，尤以低葉酸攝入的人群為著。本研究結(jié)果中也顯示CHD 與非CHD 組的MTHFR基因構(gòu)成分布及T/C 等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示：攜帶T 等位基因的患者更容易發(fā)生CHD，MTHFRC677T 基因突變純合子TT 型與CHD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

腦小血管?。–SVD）主要以腦內(nèi)微小動(dòng)脈血管病變?yōu)橹鳎桥R床上常見的隨年齡增長而伴發(fā)的一種疾病。CSVD 在MRI 上主要表現(xiàn)為腔隙性腦梗死（LI）、腦白質(zhì)病變、陳舊性腦微出血、腦萎縮等。王立俠等［13］認(rèn)為引起腦小動(dòng)脈內(nèi)皮損傷所需的Hcy 濃度低于在主動(dòng)脈中引發(fā)同類效應(yīng)所需的濃度，也就是說腦小血管對(duì)HHcy 水平更為敏感。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［14］，Hcy 與CSVD 的預(yù)后與風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，血漿Hcy 水平越高，CSVD 患者的認(rèn)知功能評(píng)分越低。JEON 等［15］研究也表明，TT型與血漿中高Hcy 水平有關(guān)，與動(dòng)脈粥樣硬化性大血管病及腦小血管病的發(fā)病無關(guān)，但RUTTEN等［16］發(fā)現(xiàn)，T 等位基因與LI 及腦白質(zhì)病變均有關(guān)，且TT 型與LI 的發(fā)病具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果顯示，在腦小血管病中，LI 組與非LI 組之間的血漿Hcy 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在老年群體中血漿Hcy 水平與CVSD 無相關(guān)關(guān)系；但LI 組與非LI 組的TT 等位基因分布及T/C 等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示攜帶T 等位基因者LI 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。

頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）是動(dòng)脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)，頸動(dòng)脈硬化及硬化程度可用來預(yù)測(cè)心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。姜紅霞等［18］在校正了性別、年齡、高血壓、糖尿病等因素后，認(rèn)為HHcy與頸動(dòng)脈狹窄程度密切相關(guān)。另外，趙成敏等［19］研究表明在HHcy 人群中，血漿Hcy 水平與IMT 呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。CATENA 等［20］發(fā)現(xiàn)血漿Hcy水平與頸動(dòng)脈斑塊發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；聶穎等［21］認(rèn)為血漿Hcy 水平與頸動(dòng)脈斑塊的分布與程度有關(guān)；吳慶慶等［22］研究表明MTHFRC677T 基因突變純合子TT 型會(huì)導(dǎo)致較高的IMT 和頸動(dòng)脈斑塊發(fā)生率。但李振洲等［23］則認(rèn)為MTHFR基因多態(tài)性突變對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化無直接致病關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，血漿Hcy 水平與IMT 未見相關(guān)關(guān)系；MTHFR基因多態(tài)性C677T 基因突變純合子TT 型對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化的致病性及嚴(yán)重程度均未見直接相關(guān)關(guān)系，與李振洲等［22］的研究結(jié)果一致。

另外，本研究結(jié)果顯示，腦梗死組MTHFR基因TT 型和CT 型患者比例顯著高于非腦梗死組（P＜0.01），說明MTHFRC677T 突變與腦梗死的發(fā)生密切相關(guān)，與文獻(xiàn)［24-25］報(bào)道一致。

本研究結(jié)果顯示：在CHD 和LI 分組中，疾病組和非疾病組的血漿Hcy 水平差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究入選病例年齡普遍較大、Hcy水平普遍較高有關(guān)；另外，本研究還存在一些不足之處，由于本研究研究對(duì)象為老年人群，受患者年齡和所需影像學(xué)檢查數(shù)據(jù)等因素的限制，故最后能滿足研究所需的完整病案資料的病例數(shù)較少，在864 例老年患者中只篩選出294 例，所以還缺乏大數(shù)據(jù)支持。同時(shí)本研究未對(duì)CHD 和LI 并發(fā)病例進(jìn)行單獨(dú)討論，對(duì)患多種疾病病例的分析可能還不夠全面。后續(xù)還將進(jìn)一步擴(kuò)大觀察病例數(shù)和年齡段、細(xì)化入選對(duì)象、建立回歸分析模型，并對(duì)影像學(xué)數(shù)據(jù)作進(jìn)一步的量化處理以期得到更有效、更精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

近年，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)已得到學(xué)者們的高度重視，基因檢測(cè)作為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，有望進(jìn)一步結(jié)合臨床影像學(xué)改變而助力預(yù)防醫(yī)學(xué)發(fā)展，也就是說可通過對(duì)不同基因型的人群實(shí)施疾病的早期預(yù)防性管理、個(gè)體化用藥，以達(dá)到降低心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和致殘風(fēng)險(xiǎn)的目的。