吳謝慧 賴銘裕 姜丹 張?zhí)镉?蔣麗萍 方子良 梁海秋

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科（南寧530021）

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，我國2014年新發(fā)病例約40 萬例，占世界總發(fā)病例數(shù)的42%［1］。因此，闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制在胃癌預(yù)防、早期診斷及治療策略中有著舉足輕重的作用。

近年來研究表明長鏈非編碼RNA（long nonprotein codingRNA，LncRNA）與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［2-4］。其中，HOTAIR 在多種腫瘤中有異常表達(dá)，并且其表達(dá)量與腫瘤的轉(zhuǎn)移、進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)［5］，提示HOTAIR 可能成為腫瘤診斷有力的預(yù)測指標(biāo)及治療靶點。為了探討HOTAIR 在胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系，本研究通過對胃癌SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，探討HOTAIR 表達(dá)量對胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖凋亡的影響，并通過qRT-PCR 檢測細(xì)胞的微小非編碼RNA-126（microRNA 126，miR-126）表達(dá)量，探討HOTAIR 影響胃癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胃癌SGC-7901 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胰酶及胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；RPMI-1640 及DMEM 培養(yǎng)基購于Hy-Clone 公司；HOTAIR 過表達(dá)質(zhì)粒、慢病毒與小干擾HOTAIR（si-HOTAIR）質(zhì)粒由鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司構(gòu)建合成；CCK-8 試劑盒、Annexin VFITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent 試劑購自invitrogen 公司；慢病毒滴度檢測試劑盒購自鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 將體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901 分為：空白對照組即Blank 組（單純的SGC7901 細(xì)胞株）；HOTAIR 過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染HOTAIR 過表達(dá)質(zhì)粒）；si-HOTAIR 組：（轉(zhuǎn)染si-HOTAIR 質(zhì)粒）。培養(yǎng)條件：37 ℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，HOTAIR 過表達(dá)組培養(yǎng)基為RPMI +10%FBS+1%P/S+400 μg/mL G418，si-HOTAIR 組培養(yǎng)基為RPMI+10%FBS+1%P/S+0.2 μg/mL Puromycin，Blank 組培養(yǎng)基為RPMI+10%FBS+1%P/S。

1.3 細(xì)胞株構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建lncRNA-HOTAIR穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株HOTAIR 過表達(dá)質(zhì)粒信息為：pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Neo Vector。HOTAIR 正向引物序列 為：5′-ACATTCTGCCCTGATTTCC-3′，反向引物序列為：5′-AGTGCCTGGTGCTCTCTTAC-3′；無血清培養(yǎng)基中加入pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Neo Vector 表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒2nd Generation Packaging Mix。將Lentifectin 與無血清培養(yǎng)基的混合溶液加入到質(zhì)?；旌先芤褐?，得到DNA/LentiFectin 混合物。48 h 后收集濃縮的病毒顆粒并包裝細(xì)胞。最后確定HOTAIR 過表達(dá)細(xì)胞株的藥篩濃度為400 μg/mL。

1.3.2 構(gòu)建si-HOTAIR 細(xì)胞株 si-HOTAIR 質(zhì)粒信息為：piLenti-siRNA-GF。無血清培養(yǎng)基中加入pilenti-siRNA-GFP Vector 表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒2nd Generation Packaging Mix。將Lentifectin 與無血清培養(yǎng)基的混合溶液加入到質(zhì)?；旌先芤褐?，得到DNA/LentiFectin 混合物。48 h 后收集濃縮的病毒顆粒包裝細(xì)胞。最后確定si-HOTAIR 細(xì)胞株的藥篩濃度為0.2 μg/mL。

1.4 實時定量熒光PCR（RT-qPCR） 提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計檢測RNA 的濃度和質(zhì)量。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入引物及內(nèi)參GAPDH等，置于7300 HT 熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，1 個循環(huán)；PCR 反應(yīng)95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-126 的相對表達(dá)量。

1.5 CCK8 實驗 96 孔板中每孔加入100 μL 密度為5 × 104/mL 細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中下培養(yǎng)7 d，每天固定時間對各組細(xì)胞分別進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測，讀取數(shù)值前對各組細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基，并在每孔中加入10 μL CCK-8 溶液；在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。OD450測定吸光值并保存數(shù)值。

1.6 平板克隆形成實驗 每組設(shè)置3 個培養(yǎng)皿，每皿約種100 個細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。用PBS 浸洗后加入5 mL 4%多聚甲醛固定20 min，然后用結(jié)晶紫染色，清洗染液后晾干拍照。計數(shù)每個培養(yǎng)孔內(nèi)形成的克隆。克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù) 將各細(xì)胞按照5 × 105細(xì)胞/孔的密度鋪6 孔板，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，待第二天細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時收集細(xì)胞并計數(shù)。取5 ～10 × 104細(xì)胞，離心后加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5μL Annexin V-FITC、10 μL 碘化丙啶染色液混勻。室溫條件下避光孵育10 ～20 min，隨后將其置于冰浴中。在1 h 之內(nèi)完成檢測。

1.8 Caspase3/7 活性檢測 每組設(shè)置3 個復(fù)孔，每孔加入約5 000 個細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后，將Caspase-Glo3/7 底物和緩沖液混合，取100 μL 混合液加入孔中，混合孵育1 h 后酶標(biāo)儀測波長405 nm 處的吸光值，計算處理組吸光度與對照組吸光度的比值，確定活化程度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。各組實驗數(shù)據(jù)均用表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)情況 如圖1所示，HOTAIR 過表達(dá)組的胃癌細(xì)胞較Blank 組細(xì)胞中HOTAIR 表達(dá)量顯著上升；而si-HOTAIR 組的胃癌細(xì)胞較Blank 組細(xì)胞中HOTAIR 表達(dá)量下降，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HOTAIR 對胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖能力的影響 CCK8 結(jié)果見圖2。第1 天到第7 天HOTAIR過表達(dá)組與Blank 組的細(xì)胞增殖情況比較的P值分 別 為0.199、0.360、0.042、0.040、0.001、0.028、0.012，從第3 天開始兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過表達(dá)組的細(xì)胞增殖水平高于空白對照組。另一方面，si-HOTAIR組與Blank組的細(xì)胞增殖情況比較的P值為0.000、0.003、0.000、0.002、0.001、0.004、0.002，從第1 天開始，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），si-HOTAIR 組的細(xì)胞增殖水平明顯低于Blank組。

圖1 qRT-PCR 檢測各組細(xì)胞HOTAIR 表達(dá)量Fig.1 The expression of HOTAIR in cells was detected by qRT-PCR

圖2 CCK8 法檢測各組細(xì)胞增殖能力Fig.2 Proliferation avtivities of cells in various groups detected by CCK8 method

平板克隆形成實驗結(jié)果見圖3。HOTAIR 過表達(dá)組的克隆形成率分別為56.0%，46.3%，53.3%；與之對照的Blank 組的克隆形成率分別為31.8%，35.0%，36.9%。HOTAIR 過表達(dá)組細(xì)胞克隆形成率高于Blank 組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.006）。si-HOTAIR 組克隆形成率分別為22.8%，25.2%，27.6%；與之對照的Blank 組克隆形成率分別為34.0%，41.8%，48.9%。si-HOTAIR 組細(xì)胞克隆形成率低于Blank 組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.022）。

圖3 平板克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞增殖生長能力Fig.3 Proliferation avtivities of cells in various groups detected by colony formation assay

2.3 HOTAIR 對胃癌SGC-7901 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果見圖4，過表達(dá)組中細(xì)胞的凋亡率分別為2.53%，1.51%，2.54%，與之進(jìn)行對照的Blank組的凋亡率分別為5.65%，5.18%，4.54%，HOTAIR 過表達(dá)組的凋亡率較低于Blank 組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）；另一方面，si-HOTAIR 組的凋亡率分別為14.88%，15.02%，19.22%，與之對照的Blank組的凋亡率分別為5.11%，5.19%，4.66%，si-HOTAIR 組的凋亡率明顯高于Blank組，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis effects of cells in various groups detected by flow cytometry

Caspase3/7 活性實驗結(jié)果見圖5，HOTAIR 過表達(dá)組的熒光光強(qiáng)明顯弱于Blank 組，即過表達(dá)組的凋亡率低于Blank 組；si-HOTAIR 組的熒光光強(qiáng)明顯強(qiáng)于Blank 組，即HOTAIR 過表達(dá)時抑制細(xì)胞凋亡，而HOTAIR 沉默時細(xì)胞凋亡被促進(jìn)。

2.4 實時熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞miR-126 的表達(dá)情況 如圖6所示，HOTAIR 過表達(dá)組細(xì)胞的miR-126 表達(dá)水平較Blank 組細(xì)胞降低，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而si-HOTAIR組細(xì)胞的miR-126 表達(dá)水平較Blank 組細(xì)胞顯著增高，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

長鏈非編碼RNA 是一類長度大于200 bp 的非編碼RNA，在多種生物進(jìn)程中均發(fā)揮重要的作用［6-7］，HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR），是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA，長約2 158 nt，位于哺乳動物基因組12q13 上HOXC位點［5］。GUPT 等［8］發(fā)現(xiàn)，HOTAIR 可參與染色質(zhì)的修飾，靶向結(jié)合多梳狀抑制性復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2），將其募集到HOXC位點，導(dǎo)致H3 組蛋白第27 位賴氨酸（histone H3 lysine K27，H3K27）三甲基化和HOXC 位點表觀遺傳沉默。

圖5 Caspase3/7 實驗檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis effects of cells in various groups detected by Caspase3/7 assay

圖6 qRT-PCR 檢測各組細(xì)胞miR-126 表達(dá)量Fig.6 The expression of miR-126 in cells was detected by qRT-PCR

在乳腺癌中，HOTAIR 在乳腺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中存在高表達(dá)，并且其在原發(fā)灶的高表達(dá)量與患者的無轉(zhuǎn)移生存率及總體生存率下降有關(guān)［8］。GENG 等［9］發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，肝癌組織中的HOTAIR 表達(dá)量明顯升高，腫瘤中HOTAIR 高表達(dá)的患者在肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加。HOTAIR表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間也存在顯著相關(guān)性。HOTAIR基因敲除后，肝癌細(xì)胞增殖被抑制，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白水平降低，HOTAIR 可能是肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物［9］。

PADUA 等［10］發(fā)現(xiàn)，HOTAIR 在胃癌組織中的表達(dá)水平高于配對癌旁組織，并且在胃癌患者血漿中的水平也高于健康對照者。血漿中HOTAIR水平與癌組織HOTAIR 水平呈正相關(guān)，且HOTAIR高表達(dá)可促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及EMT 進(jìn)展［10-11］，提示HOTAIR 過表達(dá)是胃癌預(yù)后差的標(biāo)志物。除此之外，HOTAIR 還在結(jié)直腸癌、胰腺癌等腫瘤中存在異常表達(dá)，并且在這些腫瘤的增殖及遷移中起重要作用［12-14］。

本實驗通過對胃癌SGC-7901 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染使其表達(dá)不同HOTAIR 水平，分別與Blank 組進(jìn)行對照，驗證了胃癌細(xì)胞中HOTAIR 過表達(dá)時促進(jìn)胃癌SGC-7901 細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡；當(dāng)HOTAIR 基因被沉默后，胃癌細(xì)胞增殖也被抑制，而細(xì)胞凋亡率上升。

有研究報道，在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，HOTAIR 與微小非編碼RNA 126-5p（miR-126-5p）有潛在結(jié)合位點，HOTAIR 可能作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）通過互補(bǔ)序列下調(diào)miR-126，從而影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展［15］。也有研究報道，HOTAIR 可能通過ceRNA 競爭性結(jié)合miR-126 從而激活下游PI3K/AKT/MRP1 通路，影響胃癌對順鉑的耐藥性［16］。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌SGC-7901 細(xì)胞中miRNA-126 的表達(dá)與HOTAIR 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，猜測HOTAIR 可能通過相似機(jī)制調(diào)節(jié)miR-126，從而影響胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡，本文僅從qRT-PCR 方面探討其可能性，下一步將采用雙熒光素酶實驗檢測HOTAIR與miR-126 結(jié)合位點、改變miR-126 表達(dá)量等方法繼續(xù)研究其具體機(jī)制。

綜上所述，HOTAIR 能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡，其機(jī)制可能與miR-126 的表達(dá)量有關(guān)。本研究為胃癌的治療及預(yù)后提供了新的靶點及突破口。