王丹 王芳 楊怡 萬進(jìn)東 劉森 冉飛 夏思維 王沛堅(jiān)

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1心血管內(nèi)科，2衰老與血管穩(wěn)態(tài)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都610500）

有研究數(shù)據(jù)表明，全球糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者近4 億，我國已達(dá)1.14 億，成年人中更有約50%屬DM 前期［1］。2 型DM（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生、發(fā)展與胰島素抵抗和胰島功能衰竭等因素密切相關(guān)［2］。

研究發(fā)現(xiàn)，一些膳食因素和天然藥物成分具有良好的降糖和改善胰島素抵抗的作用，且不良反應(yīng)少，患者依從性好。近年研究［3-6］表明，來源于我國傳統(tǒng)中藥肉桂中的桂皮醛（cinnamaldehyde，CA）具有降低血糖、改善脂質(zhì)代謝、舒張血管、抗氧化應(yīng)激的作用。CA 可通過刺激骨骼肌葡萄糖攝取和糖原生物合成，激活糖原合酶，和抑制糖原合成酶激酶-3 的方式改善糖代謝［7］。以上研究著重探討了CA 改善糖代謝作用，但對胰島形態(tài)及功能的作用尚不明確。為此，在本研究中，將采用db/db 小鼠作為研究對象，觀察CA 對其胰島形態(tài)及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)于2017年4月開始，將8周齡SPF 級雄性db/db 小鼠20 只（35～40 g，購于南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），分普通飲食組（db/db Cont，n=10）和0.2%CA（飼料中添加0.2%CA）飲食組（db/db CA，n=10）。另取背景相同的血糖正常小鼠C57BL/KsJ（17 ～25 g，n=10）給予普通飲食作為對照（C57 Cont，n=10）。每籠小鼠5 只，小鼠自由進(jìn)食。自然晝夜采光，室溫（21 ± 2）℃，濕度60%±10%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 CA（Sigma，美國）；水合氯醛、二甲苯和無水乙醇（中國上海凌峰化學(xué)試劑廠）；中性樹膠（中國上海懿洋）；多聚甲醛（中國上海生工）；蘇木紫染液及伊紅染液（中國南京建成）；小鼠胰島素抗體及優(yōu)泌林普通胰島素（Santa Cruz，美國）；小鼠胰島素ELISA 試劑盒（中國北京福瑞生物工程公司）；FITC 標(biāo)記的抗鼠二抗（Invitrogen，美國）；抗熒光淬滅封片液（中國碧云天）；血糖儀及血糖試紙（美國強(qiáng)生）。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）檢測 小鼠禁食6 h，利用血糖儀對鼠尾靜脈血糖進(jìn)行測量，記錄血糖值，結(jié)束后用酒精消毒創(chuàng)面。

1.2.2 胰島素耐量試驗(yàn)（intraperitoneal insulin tolerance tests，IPITT）［8］腹腔注射普通胰島素（0.75 U/kg）后，分別測0、15、30、45、60 min 鼠尾血糖值。以初始血糖值為100%，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)鼠尾血糖值與初始血糖值的百分比。

1.2.3 胰島形態(tài)觀察［9］干預(yù)結(jié)束后，小鼠禁食6 h后以10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，在獲取頸動(dòng)脈血液標(biāo)本后立即從小鼠腹腔中分離胰腺組織，包埋后在-20 ℃冷凍條件下切片，厚度為10 μm；4%多聚甲醛固定10 min 后，蘇木紫染色1 min，沖洗3 次；1%鹽酸酒精分化30 s 至1 min，沖洗3 次；流水返藍(lán)10 min；伊紅染色30 s，沖洗3 次；將切片分別放入75%酒精、95%酒精、無水酒精中3 s；二甲苯浸入2 次，每次5 min；晾干后中性樹膠封片，正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 胰島分泌胰島素水平檢測［9］胰腺組織包埋切片同前；4%多聚甲醛固定40 min，雙氧水甲醇溶液浸泡30 min 后；PBS 輕柔沖洗3 次，再用10%胎牛血清封閉30 min；加入抗小鼠胰島素抗體（1∶1 000），同時(shí)設(shè)置對照組，用PBS 替代胰島素抗體4 ℃過夜；孵育結(jié)束后常溫放置30 min，用PBS 清洗3 次，每次10 min；加入FITC 標(biāo)記的抗鼠二抗，室溫避光30 min；PBS 清洗3 次，每次10 min；倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，并計(jì)算胰島面積。

1.2.5 血漿胰島素水平檢測 小鼠成功麻醉后，從頸動(dòng)脈處取抗凝血約1 mL，離心（3 000 r/min）15 min 后取血漿，樣品及標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)包被板中37 ℃反應(yīng)30 min；洗板5次后加入酶標(biāo)試劑，37 ℃反應(yīng)30 min；洗板5次后加入顯色液顯色10 min；加入中止液；酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中讀取OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，兩組間比較采用非配對t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，兩組以上采用oneway方差分析，以Prism6.01 軟件制圖，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA 對db/db 小鼠空腹血糖和胰島素耐量試驗(yàn)的影響 在對小鼠每周的空腹血糖水平監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，與C57 Cont 相比，db/db Cont 組血糖升高明顯，但在膳食中添加0.2%CA 干預(yù)12 周后，與db/db Cont 組比較，db/db CA 組空腹血糖下降明顯（P＜0.05，圖1A）。本實(shí)驗(yàn)中小鼠胰島素耐量試驗(yàn)結(jié)果提示，與C57 Cont 及db/db Cont 組相比，CA 能夠顯著增高db/db 小鼠改善胰島素敏感性（P＜0.05，圖1B），以上結(jié)果提示膳食CA 可顯著降低db/db小鼠空腹血糖，改善db/db 小鼠胰島素抵抗，這為CA 治療T2DM 提供理論基礎(chǔ)。

圖1 CA 對db/db 小鼠空腹血糖、胰島素敏感性的影響Fig.1 Effects of CA on fasting blood glucoseandinsulin sensitivityin db/db mice

2.2 CA 對db/db 小鼠胰島形態(tài)的影響 H&E 染色觀察CA 對db/db 小鼠胰島形態(tài)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于C57 Cont 組，db/db Cont 組的胰腺組織出現(xiàn)明顯肥大，胰島細(xì)胞排列較紊亂，胰島面積明顯增大，而CA 干預(yù)后能顯著改善上述現(xiàn)象（P＜0.01，圖2），上述結(jié)果表明CA 可改善db/db 小鼠胰島形態(tài)，提示CA 改善糖代謝的作用可能與受損胰島細(xì)胞的修復(fù)有關(guān)。

圖2 H&E 染色觀察db/db 小鼠胰島形態(tài)Fig.2 H&E staining of islet morphology in db/db mice

2.3 CA 對db/db 小鼠胰島素分泌功能的影響 免疫熒光染色。結(jié)果提示db/db Cont 組胰島中胰島素含量低于C57 Cont 組，但db/db CA 組胰島中胰島素水平較db/db Cont 組明顯升高（P＜0.01，圖3），表明CA 可通過修復(fù)胰島細(xì)胞功能、促進(jìn)胰島分泌胰島素來改善糖代謝。

圖3 熒光染色觀察db/db 小鼠胰島中胰島素水平Fig.3 Immunofluorescence staining of islet insulin levels in db/db mice

2.4 CA 對db/db 血漿胰島素水平的影響 胰島素ELISA 試劑盒測定CA 對db/db 血漿胰島素水平的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于C57 Cont 組，db/db Cont 組的胰島素水平下降明顯；而與db/db Cont 組相比，db/db CA 組胰島素水平明顯升高（圖4；P＜0.01）。結(jié)果表明，CA 具有升高血漿胰島素水平的作用，進(jìn)一步肯定了CA 在糖代謝中的重要作用。

圖4 CA 對db/db 小鼠血漿胰島素水平的影響Fig.4 Effects of CA onplasma insulin levelindb/db mice

3 討論

近年來，T2DM 所致的大血管及微血管并發(fā)癥使冠心病、慢性腎功能衰竭、腦卒中、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的發(fā)生率逐年升高［1］；對人類的健康和生命造成嚴(yán)重威脅，因此積極尋找控制血糖，治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的藥物及干預(yù)方法對于降低糖尿病導(dǎo)致的致死、致殘率，改善患者生活質(zhì)量，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)有重要的意義。

胰島具有分泌胰島素與胰高血糖素等激素的功能，在糖代謝、脂代謝等代謝途徑中起著非常重要的作用。其中胰島β 細(xì)胞具有分泌胰島素的功能，其衰竭是T2DM 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。而持續(xù)性高血糖刺激可導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞退化成無效的β 細(xì)胞，進(jìn)而喪失部分及全部的胰島素分泌功能［10］，因此保護(hù)和改善胰島β 細(xì)胞對T2DM 的治療尤其重要。CA 原產(chǎn)于斯里蘭卡和印度的南部，當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)醫(yī)師用于治療糖尿病。隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，他人研究發(fā)現(xiàn)CA 可通過上調(diào)小鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）基因表達(dá)來下調(diào)血糖［11］，可通過抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase.1B，PTP.1B）來改善胰島素抵抗，從而達(dá)到治療和預(yù)防糖尿病的作用［12］。然而CA 對胰島形態(tài)及功能作用未作進(jìn)一步研究，為此，本課題組以胰島作為切入點(diǎn)進(jìn)一步展開研究。

本研究發(fā)現(xiàn)CA 可顯著降低db/db 空腹血糖水平，研究證實(shí)CA 可通過增加葡萄糖攝取和改善肝臟中的糖原合成從達(dá)到降低空腹血糖作用［13-14］。CA 可增加胰島素敏感性，有文獻(xiàn)提示CA 可通過降低血漿中炎癥因子及抑制炎癥因子的表達(dá)來改善胰島素抵抗［15］。在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察了CA對小鼠胰島形態(tài)及功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA 可顯著改善db/db 小鼠胰腺體積增大及胰島細(xì)胞排列紊亂，同時(shí)能增加胰島素分泌量和升高血漿胰島素水平；此外，有研究發(fā)現(xiàn)，激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2.related factor 2，Nrf2），可減輕氧化應(yīng)激對胰島β細(xì)胞損傷、改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型的代謝紊亂［16-17］，但CA 對db/db 小鼠胰島形態(tài)與功能的保護(hù)作用，是否與激活Nrf2 有關(guān)是后期的實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)。

綜上所述，CA 可改善db/db 小鼠胰島形態(tài)及功能，從而改善糖代謝；這為糖尿病患者的治療提供了新的理論基礎(chǔ)，有利于開發(fā)新的干預(yù)靶點(diǎn)和治療措施。