羅凱 黎謝夢丹 鄭國沛 劉浩 賈小婷 王倩 張志杰 賀智敏

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院/廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所（廣州510095）

肺癌是嚴重威脅大眾健康的重要惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占80% ～85%。目前，以吉非替尼為代表的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成為EGFR 突變型NSCLC 的重要全身治療手段之一，然而無可避免的EGFR-TKI 耐藥嚴重影響了其臨床應用［1］。目前仍有相當比例患者耐藥機制未明［2］。因此，進一步尋找EGFRTKI 耐藥靶標，闡述耐藥機制對于有效逆轉EGFRTKI 耐藥，提高肺癌綜合治療效果具有十分重要的理論意義和潛在的應用價值。

miRNA 是一類20 bp 左右的單鏈小分子RNA，其主要通過與靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)的部分或完全結合來抑制靶基因mRNA 的翻譯過程或促進其降解。越來越多的研究表明miRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮了重要的作用［3-4］。該研究前期已利用吉非替尼敏感NSCLC 細胞HCC827成功構建了繼發(fā)耐藥細胞株HCC827/G 且還排除了目前已知的主要耐藥機制在HCC827/G 吉非替尼耐藥中的作用，如EGFR 基因T790M 突變等，同時二代測序結果顯示HCC827 和HCC827/G 細胞外泌體miRNA 表達譜存在很多差異，其中miR-17-5p在HCC827/G 細胞中表達升高，提示其可能與吉非替尼耐藥相關［5］。近來研究表明miR-17-5p 是一種癌基因，促進了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［6］。因此該研究擬證實miR-17-5p 介導NSCLC 吉非替尼耐藥的作用并探討其可能機制，旨在尋找新的耐藥靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HCC827 細胞株購自中國科學院上海細胞所，HCC827/G 細胞為前期通過低濃度吉非替尼持續(xù)誘導HCC827 細胞構建。吉非替尼治療前血清4 例與治療耐藥后血清3 例均收集自2016年至2017年間廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院確診的NSCLC 患者，其中男3 例，女4 例，年齡57 ～81 歲。

1.2 試劑和儀器 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自BI。吉非替尼購自MCE。QRT-PCR 試劑購自TaKaRa。miR-17-5p 相關引物、mimics 和inhibitor、PTEN shRNA、PTEN 3′UTR 區(qū)雙熒光素酶報告基因質粒均購自復能。PTEN 抗體購自CST。lipo2000購自Thermo。凋亡檢測試劑購自聯(lián)科。熒光定量PCR儀購自伯樂。流式細胞儀購自BD。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 細胞使用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，3 d 傳代一次。取對數(shù)生長期細胞進行相關實驗。

1.3.2 QRT-PCR 依說明書提取樣品RNA，測濃度后取1 μg 轉錄為cDNA。以U6 或β-actin 作為內參，設3 個復孔。引物：人β-actin：F：ATGATGATATCGCCGCGCTC，R：CCACCATCACGCCCTGG；人PTEN：F：TCCCAGACATGACAGCCATC，R：GCTTTGAATCCAAAAACCTTACTAC。U6、miR-17-5p 引物序列復能公司未提供。反應條件：95 ℃10 min；95 ℃10 s、60 ℃20 s（采集熒光）、72 ℃10 s，45 個循環(huán)；融解曲線分析。利用2-△△CT法計算各指標的相對表達量。

1.3.3 細胞轉染 依據(jù)lipo2000 說明書步驟完成細胞轉染，QRT-PCR與Western Blot檢測轉染效果。

1.3.4 MTS 實驗 取對數(shù)生長期細胞接種96 孔板，待細胞貼壁后各孔中分別加入梯度濃度吉非替尼，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μL MTS 試劑，測OD 值后繪制藥敏曲線并計算IC50值。

1.3.5 細胞凋亡分析 取對數(shù)生長期細胞，加入低濃度吉非替尼作用12 h 后，依說明書步驟將細胞染色后上流式細胞儀檢測，結果使用FlowJo 7.6軟件分析。

1.3.6 Western Blot 檢測 取對數(shù)生長期細胞提取總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度后取20 μg 蛋白行SDS-PAGE 電泳。電泳結束后轉膜、封閉，然后一抗4 ℃孵育過夜，次日孵二抗后曝光顯影。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗 將miR-17-5p mimics 分別與對照質粒和PTEN3′UTR 區(qū)雙熒光素酶報告基因質粒共轉染12 孔板中的對數(shù)生長期293T 細胞，設置3 個復孔，72 h 后取上清檢測熒光素酶活性，以GLUC 為報告基因、SEAP 為對照基因，計算對照組和實驗組的相對熒光素酶活性。

1.3.8 生物信息學分析 利用Targetscan 數(shù)據(jù)庫預測miR-17-5p 的靶基因。

1.4 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，計量資料組間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-17-5p 在耐藥HCC827/G 細胞中表達增高 QRT-PCR 結果顯示miR-17-5p在耐藥HCC827/G 細胞中表達增高，與前期二代測序結果相符，提示miR-17-5p 可能參與介導吉非替尼耐藥（圖1）。

圖1 miR-17-5p 在HCC827 和HCC827/G 細胞中的表達Fig.1 Expression of miR-17-5p in HCC827 and HCC827/G cells

2.2 miR-17-5p 介導了HCC827/G 細胞對吉非替尼的耐藥 HCC827 細胞中過表達miR-17-5p 后（圖2A），細胞對吉非替尼的IC50值為（27.48±4.04）μmol/L，較對照組的（2.70 ± 0.86）μmol/L 明顯增高（圖2B），提示細胞耐藥性增加。在HCC827/G 細胞中敲低miR-17-5p 后（圖2C），25 μmol/L 吉非替尼對細胞的相對抑制率較對照組明顯增加（圖2D），提示細胞耐藥性降低。表明miR-17-5p 介導了HCC827/G 細胞的吉非替尼耐藥。

圖2 HCC827 和HCC827/G 細胞分別轉染miR-17-5p mimics 和inhibitor 后的耐藥性變化Fig.2 Changes of drug resistance after HCC827 and HCC827/G cells transfected with miR-17-5p mimics and inhibitor，respectively

2.3 miR-17-5p 抑制了吉非替尼誘導的肺癌細胞凋亡 HCC827 過表達miR-17-5p 后，細胞凋亡率較對照明顯減少（圖3A）。HCC827/G 敲低miR-17-5p 后，細胞凋亡率較對照明顯增加（圖3B）。表明miR-17-5p 可降低吉非替尼誘導細胞凋亡的效果。

圖3 HCC827 和HCC827/G 細胞分別轉染miR-17-5p mimics 和inhibitor 后的細胞凋亡變化Fig.3 Apoptosis of HCC827 and HCC827/G cells transfected with miR-17-5p mimics and inhibitor，respectively

2.4 miR-17-5p靶向抑制PTEN介導HCC827/G細胞對吉非替尼的耐藥 生信分析預測到PTEN 為miR-17-5p 的靶基因（圖4A）。QRT-PCR 與Western Blot 結果均顯示PTEN 在HCC827/G 中的表達較HCC827 明顯降低（圖4B、4C）。當HCC827 過表達miR-17-5p 后，PTEN 表達明顯下調（圖4D、4E）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示轉入miR-17-5p mimics 后，實驗組相對熒光素酶活性較對照組明顯下降（圖4F）。提示miR-17-5p 可靶向抑制PTEN 基因的表達。

在HCC827 中敲低PTEN 后（圖4G），3.13μM吉非替尼對細胞的相對抑制率較對照組明顯降低（圖4H），提示PTEN 參與介導吉非替尼耐藥。進一步功能阻斷實驗結果顯示，同時敲低PTEN 可逆轉單獨敲低HCC827/G 的miR-17-5p 表達導致的吉非替尼耐藥性降低（圖4I）。以上結果表明miR-17-5p 通過靶向抑制PTEN 介導了HCC827/G 細胞對吉非替尼的耐藥。

圖4 miR-17-5p 靶向抑制PTEN 介導HCC827/G 細胞對吉非替尼的耐藥Fig.4 miR-17-5p mediated HCC827/G cell resistance to gefitinib by inhibiting the expression of PTEN

2.5 吉非替尼耐藥后NSCLC 患者血清miR-17-5p表達水平升高 QRT-PCR結果顯示3例吉非替尼耐藥后NSCLC患者血清中miR-17-5p的表達水平明顯高于4 例吉非替尼治療前NSCLC 患者。見圖5。

3 討論

圖5 吉非替尼耐藥后NSCLC 患者血清中miR-17-5p 表達水平的變化Fig.5 Changes of serum miR-17-5p expression in NSCLC patients of gefitinib resistance

NSCLC 約占肺癌的80% ～85%且發(fā)現(xiàn)時大多患者已處于晚期而失去手術治療的機會，化療是其最主要的全身治療方式，但是明顯的毒副作用限制了化療在晚期NSCLC 治療中的作用。近年研究證明［7］，使用EGFR-TKI 靶向治療EGFR 基因突變型NSCLC 可獲得較化療更好的療效且毒副作用小，因此其已成為另一種重要的NSCLC 全身治療方式。吉非替尼為EGFR-TKI 的代表性藥物。然而，大部分NSCLC 的EGFR-TKI 靶向治療會在12個月左右出現(xiàn)耐藥，這嚴重影響了其臨床應用［8］。目前已發(fā)現(xiàn)的耐藥機制主要包括三個方面［8］：（1）二次EGFR 基因突變，如T790M 突變；（2）下游旁路信號途徑激活，如Kras 基因突變、MET 擴增等；（3）組織學類型的轉化，如NSCLC 轉化為小細胞肺癌等。但仍有近30%的患者耐藥機制不明。因此，進一步尋找EGFR-TKI 耐藥靶標并闡明其耐藥機制對于逆轉EGFR-TKI 耐藥具有重要意義。

HCC827 是EGFR 基因19del 突變且對吉非替尼敏感的人NSCLC 細胞株。該研究前期不僅成功構建了吉非替尼繼發(fā)耐藥細胞株HCC827/G，而且還排除了目前已知的主要耐藥機制在HCC827/G吉非替尼耐藥中的作用［5］。提示HCC827/G 中還存在著新的吉非替尼耐藥機制。通過分析外泌體二代測序結果，該研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p 在HCC827/G外泌體中的含量增加，進一步QRT-PCR 實驗證實miR-17-5p在HCC827/G細胞中的表達也增加，提示miR-17-5p可能介導了HCC827/G的吉非替尼耐藥。

miR-17-5p 屬于miR-17-92 miRNA 簇。有研究［9］報道m(xù)iR-17-92 miRNA 簇在多種腫瘤中發(fā)揮了癌基因的作用，miR-17-92 miRNA 簇的過表達是關鍵致癌事件。CHEN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p在81 例鼻咽癌患者腫瘤組織中高表達，且高表達miR-17-5p 患者的總生存時間較低表達患者明顯縮短。宋先璐等［11］報道m(xù)iR-17-5p、miR-92a 和let-7b 在順鉑耐藥NSCLC 細胞株中表達升高，該組miRNA 通過抑制細胞凋亡和促進細胞增殖介導了NSCLC 的順鉑耐藥。以上研究表明miR-17-5p 在多種腫瘤中發(fā)揮了癌基因的作用，miR-17-5p 參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及化療耐藥等生物學過程。然而關于miR-17-5p 與非小細胞肺癌EGFR-TKI靶向治療耐藥的相關研究報道尚未見報道，該研究首次發(fā)現(xiàn)miR-17-5p參與介導了非小細胞肺癌的EGFR-TKI 靶向治療耐藥。BOBBILI 等［12］報道m(xù)iR-17-5p 可以通過外泌體和細胞外囊泡的形式向細胞外釋放以實現(xiàn)細胞間的通訊并執(zhí)行相關生物學功能。該研究前期就以吉非替尼敏感和耐藥細胞的外泌體作為研究對象，通過分析發(fā)現(xiàn)了miR-17-5p在耐藥細胞外泌體中的高表達狀態(tài)。然后該研究進一步通過QRT-PCR證實了miR-17-5p在耐藥細胞內的高表達狀態(tài)。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)在敏感的HCC827 細胞中轉入miR-17-5p mimics 后細胞對吉非替尼的IC50值明顯增加且細胞凋亡率降低，而耐藥的HCC827/AR 細胞中轉入miR-17-5p inhibitor 后吉非替尼對細胞的抑制率明顯增加且細胞凋亡率增加，這從正反兩個方面證實miR-17-5p 介導了NSCLC的吉非替尼耐藥，且該過程可能是通過miR-17-5p靶向調控凋亡相關基因來實現(xiàn)的。

BOBBILI 等［12］綜述了已有報道的miR-17 靶基因，其中與凋亡調控相關的基因有PTEN 與P21等。該研究通過生物信息學分析也預測到了PTEN 為miR-17-5p 的下游靶基因。因此該研究將凋亡相關基因PTEN 選為miR-17-5p 下游靶基因的候選基因進行下一步研究。相關研究［13］報道多種腫瘤中PTEN 基因的缺失或突變可導致PTEN 表達的缺失或下調，而作為負性調控因子，PTEN 表達的缺失或下調可通過激活PI3K/Akt 信號通路來抑制腫瘤細胞的凋亡并促進其增殖，從而促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。該研究顯示，PTEN 在吉非替尼耐藥細胞株HCC827/G 中表達下調，而在PTEN 高表達的敏感細胞HCC827 中轉入miR-17-5p mimics后PTEN表達也明顯下調。同時雙熒光素酶報告基因實驗也證實了miR-17-5p 對PTEN 表達的抑制作用。此外該研究還通過在吉非替尼敏感HCC827 細胞中敲低PTEN 后檢測到吉非替尼對細胞的相對抑制率降低和功能阻斷實驗證實了PTEN 參與了HCC827/G 細胞對吉非替尼的耐藥。而這些結果均表明miR-17-5p 可通過靶向抑制PTEN 基因表達介導HCC827/G 細胞對吉非替尼的耐藥。

最后，該研究還發(fā)現(xiàn)在吉非替尼耐藥后的NSCLC 患者血清中的miR-17-5p 表達水平較治療前升高，提示miR-17-5p 還有望作為耐藥監(jiān)測的指標之一。但由于耐藥監(jiān)測以及標本二次取樣困難等原因導致該研究所收集的樣品數(shù)量偏少，這是該研究的不足，因此該研究下一步擬繼續(xù)收集耐藥后的臨床樣品以完成后續(xù)的更大樣品量的臨床驗證工作。

綜上所述，miR-17-5p 通過靶向下調PTEN 基因表達抑制細胞凋亡促進非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥，其有望成為吉非替尼耐藥新靶點。