陳瑾歆，莫 琳，王含彥

胰腺癌起病隱匿，發(fā)展迅速，手術(shù)切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后極差，是嚴重危害人類健康的惡性疾病之一［1］。 神經(jīng)周浸潤（perineural invasion，PNI）是胰腺癌的一項病理學(xué)特征［2］，廣義的PNI是指腫瘤細胞包繞神經(jīng)表面或浸潤神經(jīng)外膜或進入神經(jīng)束膜以內(nèi)［3］，被認為是胰腺癌轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)的一種方式［2］。有研究報道胰腺癌PNI發(fā)生率與患者的手術(shù)切除率、術(shù)后復(fù)發(fā)率和平均生存期直接相關(guān)［4］。因此研究有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌特異表達的基因?qū)σ认侔┑脑缙谠\斷、手術(shù)選擇和術(shù)后干預(yù)有重要意義。

該研究通過觀察基質(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMPs）和組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）在有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織和癌旁組織中的表達，探討基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶的組織抑制劑在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展和早期轉(zhuǎn)移中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料胰腺癌癌旁組織和腫瘤組織從川北醫(yī)學(xué) 院 附 屬 醫(yī) 院 獲 得 ；TRIZOL （Invitrigon）；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）；SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）；全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物有限公司）；BCA Protein Assay Kit（Thermo，23227）；PAGE 凝膠制備試劑盒（Promoton，PG112）；一抗：抗 MMP-2、MMP-9、TIMP-2、GAPDH抗體（CST，USA）；熒光標(biāo)記羊抗兔二抗（KPL，USA）。

1.2方 法

1.2.1 分組 實驗分為癌旁對照組、有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組。

1.2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 取22例胰腺癌患者癌旁組織和腫瘤組織HE染色鑒定有無神經(jīng)周浸潤，將檢測有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織和癌旁對照組織用預(yù)冷的PBS洗3遍，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-qPCR 將有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織和癌旁組織碾細，加入TRIZOL裂解液，按說明書方法提取總RNA，NanoDrop 2000微量分光光度計檢測RNA含量與純度，采用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進行鑒定。根據(jù)260 nm光吸收值計算總RNA的濃度，以O(shè)D260/OD280確定純度。用約 1.5 μg總 RNA 為模板，采用試劑盒（Takara）提供的方法去除基因組DNA污染，合成cDNA。用合成cDNA進行在實時定量檢測擴增儀上擴增模板并檢測熒光，qPCR 反應(yīng)體系為 20 μl：SYBY qPCR mix 10.0 μl，特異上下游引物（10 pmol/μl）各 1 μl，cDNA模板 2.0 μl，去離子水補足 20 μl。 熒光定量 PCR 反應(yīng)條件：95℃ 變性 2 min；95 ℃ 30 s，60℃ 1 min 30 s，72℃30 s擴增40個循環(huán)，在每個循環(huán)60℃延伸時檢測熒光，循環(huán)完成后做融解曲線。所有目的基因和內(nèi)參照GAPDH的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相同。用于qPCR反應(yīng)的特異引物序列如下：MMP2-F：GGAATGAAGCACAGCAGGTCTCAG，MMP2-R：AG CCAAGCGGTCTAAGTCCAGAG；MMP9-F：TCCTGG TGCTCCTGGTGCTG，MMP9-R：CTGCCTGTCGGTG AGATTGGTTC；TIMP-2-F：TGCAGGAGGAATCGG TGAGGTC，TIMP-2-R：GAACAGGCAAGAAGCAAT GGCAAC；GAPDH-F：ATTGACCTCAACTACATGGT TTACATG，GAPDH-R：TTGGAGGGATCTCGCTCCT GGAAG（擎科生物）。根據(jù)待測cDNA中目的基因和GAPDH的Ct值，用相對定量的方法以每個樣品的目的基因 2-△△（Ct1-Ct2）作為目的基因的表達水平。

1.2.4 Western印跡試驗 將有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織和癌旁組織碾細，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，離心10 min取上清收集細胞總蛋白，經(jīng)BCA法分析定量調(diào)整蛋白濃度一致，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min。變性的蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳 （MMP-2和MMP-9） 及12%SDS-PAGE電泳（TIMP-2）分離，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗：MMP-2（1∶1000）、MMP-9（1∶1000）、TIMP-2（1∶1000）、GAPDH（1∶2000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加熒光標(biāo)記二抗 （1∶10000） 室溫孵育 1 h，TBST 洗膜，ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜成像。目的蛋白的表達水平以圖像目的蛋白與GAPDH的灰度比表示，比值越大，目的蛋白的表達水平越高。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織的鑒定取臨床胰腺腫瘤病理組織做HE染色鑒定有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織（圖1，見封三）。

圖1見封三。

2.2 q PCR檢測癌旁對照組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-2 mRNA的表達與癌旁組織比較，有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織MMP-2（P＜0.05）、MMP-9（P＜0.01）和 TIMP-2（P＜0.01）mRNA的表達均顯著增加（圖2）。

圖 2 胰腺癌癌旁組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA 的表達

2.3 免疫印跡檢測癌旁對照組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-2的表達與癌旁組織相比，有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織MMP-9（P＜0.05）和 TIMP-2（P＜0.01）的表達顯著增加；MMP-2在癌旁組織和腫瘤組織中的表達無明顯差異 （P＞0.05）。見圖 3。

3 討論

神經(jīng)周浸潤（PNI）是胰腺癌預(yù)后的獨立指標(biāo)，是胰腺癌根治術(shù)后局部復(fù)發(fā)、腹膜后蔓延和出現(xiàn)頑固性疼痛的主要原因之一［5］。PNI的分子機制尚不清楚，目前認為可能是生長因子、細胞因子、蛋白酶、激素和微環(huán)境等多種因素誘導(dǎo)腫瘤細胞游走，侵襲神經(jīng)組織［6］。

圖 3 胰腺癌癌旁組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-2 蛋白的表達

MMPs和TIMPs與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類金屬依賴性的內(nèi)源性蛋白水解酶［8］，可降解細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix Proteins，ECM）、調(diào)節(jié)細胞黏附、促進血管新生，在組織的修復(fù)及腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程中具有重要作用［9］。目前已知MMPs有 20多種， 如 MMP1、MMP2、MMP9和MMP11等。組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的抑制劑，對MMPs的功能具有調(diào)節(jié)作用［10］。TIMPs可與無活性（酶原）及活化的MMPs形成緊密穩(wěn)定的復(fù)合體，阻斷MMPs與底物結(jié)合，抑制其活性，在ECM改建、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。正常情況下，體內(nèi)的MMPs與TIMPs保持相對平衡，惡性腫瘤常伴有MMPs活性增強或TIMPs活性降低，如MMP-2和MMP-9在多種腫瘤中高表達［11］，MMP-2和 MMP-9可降解血管基底膜主要成分——Ⅳ型膠原，使腫瘤細胞能突破基底膜屏障，發(fā)生浸潤和血行轉(zhuǎn)移［12，13］。 TIMP-2 是 MMP-2 的特異性抑制劑，活性增強可抑制MMP-2的活性，抑制癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲［14］。

在該研究中，采用胰腺癌病理組織，檢測了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP9和組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2在有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織中mRNA和總蛋白的表達。結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-2mRNA的表達均顯著增加，MMP-9和TIMP-2總蛋白的表達顯著增加，MMP-2在癌旁組織和腫瘤組織中蛋白的表達無明顯差異。結(jié)果提示有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/MMP9和組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2表達明顯增加，可能與胰腺癌早期易侵襲和轉(zhuǎn)移的特性相關(guān)，而MMP-2在癌旁組織和腫瘤組織中蛋白表達增加不明顯，推測是腫瘤組織中TIMP-2是MMP-2的特異抑制劑，其高表達在一定程度上抑制了MMP-2的表達，對MMP-9則無抑制作用，MMP-9高表達可增加腫瘤細胞的黏附能力，降解血管基底膜，促進腫瘤細胞向神經(jīng)組織的轉(zhuǎn)移［11］。

綜上所述，MMP9和TIMP-2在有神經(jīng)周浸潤的胰腺癌組織中mRNA和蛋白的表達均的表達顯著增加，其特異的高表達可為胰腺癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供重要參考依據(jù)，具體的分子機制還有待進一步研究。