康展榮 傅聲揚(yáng) 俞斌 丁惠鋒， 胡健 禹寶慶 黃建明

1 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院骨科（上海201399）

2 上海理工大學(xué)材料與工程學(xué)院（上海200093）

3 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院，上海市公共衛(wèi)生臨床中心，骨科（上海200032）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷是最常見的膝關(guān)節(jié)韌帶損傷，多發(fā)生于青少年、運(yùn)動員和經(jīng)常參加體育鍛煉的人群。文獻(xiàn)報道，每年ACL 斷裂的發(fā)生率在30～78/10 萬人[1]。由于ACL 血管化[2，3]和自愈能力差[4]，斷裂后如不及時治療會繼發(fā)半月板損傷，破壞關(guān)節(jié)軟骨[5]，引發(fā)創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎。ACL 重建可以很好地恢復(fù)膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性[6]，是目前ACL斷裂后的主要治療方法。ACL 重建常用的材料有自體移植物、異體移植物和人工合成移植物。自體移植物存在手術(shù)時間長、供區(qū)損傷并發(fā)癥、來源不足等缺陷，而異體移植物術(shù)后愈合時間較長，有傳播疾病、引發(fā)免疫排斥的風(fēng)險[7]，異體移植物往往需要經(jīng)輻射或化學(xué)滅菌，使其術(shù)后失敗率也大大增加[8]。LARS（ligament advanced reconstruction system）韌帶是目前臨床上應(yīng)用最多的人工移植物，其主要成分是聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）。近年來，短期、中期和長期臨床研究[9-11]結(jié)果表明，PET 韌帶的治療效果與自體移植物相似，甚至優(yōu)于自體移植物，而且具有材料容易獲得、手術(shù)時間短、術(shù)后恢復(fù)快[3，12]等優(yōu)勢。然而，PET 材料的疏水性能是PET 韌帶的一個主要缺陷[13]，這使得PET 韌帶的細(xì)胞相容性較差，不利于細(xì)胞在其表面黏附、增殖以及血管的再生，導(dǎo)致韌帶與宿主骨之間的接合不緊密，增加手術(shù)失敗的風(fēng)險。大量的研究表明，對PET移植物的表面進(jìn)行涂層修飾，可以改善PET的疏水性能，促進(jìn)細(xì)胞在其表面的黏附、增殖和成骨分化[14，15]，體內(nèi)實驗也證實涂層修飾可以促進(jìn)移植物與宿主骨之間的愈合[16-18]。

近年來，硅酸鈣（calcium silicate，CS）生物陶瓷在骨組織工程和再生修復(fù)領(lǐng)域引起了研究者的關(guān)注。CS具有較高的親水性[19]，CS釋放的鈣、硅離子能夠誘導(dǎo)并促進(jìn)其表面羥基磷灰石層的形成，因而具有良好的生物學(xué)活性[20，21]。研究表明，CS 在體外能夠促進(jìn)成骨相關(guān)細(xì)胞的增殖分化，體內(nèi)能夠與宿主骨直接接合，促進(jìn)骨組織再生[22，23]。在CS中加入（摻入）金屬元素和（或）金屬氧化物之后，得到的復(fù)合硅酸鈣生物陶瓷（doped calcium silicate bioceramics，DCSBCs）的生物學(xué)性能得到進(jìn)一步提升。有研究表明在硅酸鈣材料中加入鈦、鋯等活性離子，可以明顯提高其生物活性和力學(xué)性能[24，25]。因此，DCSBCs 在骨再生修復(fù)領(lǐng)域有著巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。鈰（cerium，Ce）是一種稀土元素，目前被廣泛應(yīng)用于催化、燃料電池和微電子等工業(yè)領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，納米氧化鈰（CeO2）具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管再生的功能。氧化鈰材料在骨、皮膚等領(lǐng)域的研究已有文獻(xiàn)報道[26，27]，3D打印制備的CeO2摻入的介孔硅酸鈣生物支架也被證實具有良好的促進(jìn)骨再生的能力[28]。本研究將含鈰的硅酸鈣（Ce-CS）涂覆于PET人工韌帶表面，通過體外和體內(nèi)實驗來研究Ce-CS涂層對移植物-骨愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

臨床前交叉韌帶重建術(shù)后的LARS韌帶殘端。

1.1.2 材料處理和分組

將臨床ACL重建術(shù)后剩余的PET韌帶纖維于75%的酒精中浸泡4 h 去漬，然后用去離子水清洗3 遍，在37℃烘箱中烘干后，將PET 韌帶剪成與24 孔板或6 孔板孔徑大小相同的圓形。

制備10 mol%的含鈰硅酸鈣（Ce-CaSiO3）溶膠。將8.67 g Ca（NO3）2·4H2O、8.5 g原硅酸四乙酯（TEOS）和1.77 g Ce（NO3）3·6H2O在38℃下溶于130 ml蒸餾水和20.5 ml HCL溶液中，水浴24小時。

將裁剪好的PET 片浸入制備的溶膠溶液中，在磁力攪拌下浸泡5、15、30分鐘，浸漬處理的PET片為實驗組，未經(jīng)任何處理的PET 片為對照組。將所有PET 片在37℃烘箱中干燥備用。

1.1.3 主要試劑

Ca（NO3）2·4H2O、原硅酸四乙酯（TEOS）、Ce（NO3）3·6H2O、HCL 溶液（均由上海理工大學(xué)提供），α-MEM培養(yǎng)液（Hyclone 公司），胎牛血清（FBS，Gibco 公司），青-鏈霉素（Gibco 公司），0.25% Trypsin -EDTA 溶液（Gibco公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），細(xì)胞裂解液（上海威奧生物公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（Beyotime 公司），Tri?tonX-100（Sigma 公司），SYBR GREEN PCR Master Mix（Life 公司），Trizol（Invitrogen 公司），QuantiTect Re?verse Transcription Kit（QIAGEN 公司），RNA 引物（ 上海生工公司），茜素紅染劑（Solarbio），氯化十六烷基吡啶（Amresco 公司），2.5%戊二醛（北京索萊寶公司），維生素C（北京索萊寶公司），地塞米松（北京索萊寶公司），β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶公司）。

1.2 實驗動物

1.2.1 SD大鼠

4周齡、雄性SD大鼠2只（斯萊克公司）。

1.2.2 新西蘭大白兔

雄性、體重2.7 ± 0.5 kg的新西蘭大白兔12只。

1.3 方法

1.3.1 rBMSCs的提取和培養(yǎng)

將SD大鼠頸椎脫臼處死后，置于75%的乙醇中浸泡消毒5 min，剪去腹壁和后肢皮毛，取雙側(cè)股骨和脛骨，去除骨組織周圍的肌肉和軟組織，用預(yù)冷的PBS清洗3次；切除股骨、脛骨兩端的干骺端，暴露骨髓腔，用PBS 沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1000 rpm，離心8 分鐘；配置細(xì)胞培養(yǎng)所需的完全培養(yǎng)基（α-MEM培養(yǎng)基中加入10% FBS 和1%青鏈霉素）；用完全培養(yǎng)基重懸離心得到的細(xì)胞沉淀，接種到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)約7 天后細(xì)胞長至80%～90%，得到原代rBMSCs；rBMSCs 傳代培養(yǎng)，取傳至第4代的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 表面涂層及其性能檢測

將兩組的PET 韌帶噴金處理后，通過SEM 觀察材料表面形態(tài)，EDS分析材料表面的元素組成；材料表面的水接觸角實驗，檢測材料的親水性能。根據(jù)本部分實驗結(jié)果確定后續(xù)實驗中材料處理的時間。

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測

在進(jìn)行所有的細(xì)胞實驗之前，兩組PET 材料均經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌，在完全培養(yǎng)液中浸泡2小時后使用。

按1×104/孔的密度將rBMSCs 接種到24 孔板中的材料表面，在接種培養(yǎng)后的第1、3、7 天用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性。棄掉培養(yǎng)基，無血清的培養(yǎng)基清洗1遍，每孔加入40 μL CCK-8反應(yīng)液和360 μL無血清培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。反應(yīng)結(jié)束后每孔吸取200 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔板中，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。

1.3.4 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

按1×104/孔的密度將rBMSCs 接種到24 孔板中的材料表面，待細(xì)胞融合至80%時，將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（β-甘油磷酸鈉10 mM/L，維生素C50 μmol/L，地塞米松10-8mol/L），誘導(dǎo)培養(yǎng)7天、14天后檢測ALP 活性。棄掉培養(yǎng)基，PBS 清洗3 遍，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解3 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中離心，上清液即為所需細(xì)胞蛋白溶液，然后按照說明書在96孔板中加入樣品和反應(yīng)試劑，最后測定405 nm 處的吸光度。BCA 法測定蛋白液中的蛋白濃度，用以標(biāo)準(zhǔn)化ALP活性值。

1.3.5 成骨基因表達(dá)檢測

按1×105/孔的密度將rBMSCs接種到6孔板中的材料表面，細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7天、14天后，Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA。根據(jù)產(chǎn)品說明書要求，以20 μL 反應(yīng)體系將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR 為20 μL 反應(yīng)體系：Master Mix 10 μl，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Re?verse Primer 0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ROX Refer?ence Dye 0.1 μL，ddH2O 7.9 μL。反應(yīng)條件為：95℃2min 預(yù)變性，95℃ 15 s，59℃ 60 s，共40 個循環(huán)。RNA 引物序列：OCN，F(xiàn) 5'-AGGAGGGCA ATAAGG?TAGTGAA-3'，R 5'-TACCATAGATGCGTTTGTAG?GC-3'；COL-1，F(xiàn) 5'-GAGGCATAAAGGGTCATCGT?GG-3'，R 5'-CATTAGGCGCAGGAAGGTCAGC-3'；GAPDH，F(xiàn) 5'-TTGTTCCCTGCGACTTCAACA-3'，R 5'-GTGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'。

1.3.6 茜素紅染色

24孔板中的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，棄掉培液，PBS清洗3 遍，4%多聚甲醛固定10 分鐘，0.5%茜素紅常溫染色30 分鐘，PBS 清洗至水清，顯微鏡下拍照。定量：每個樣品加入500 μL 10%氯化十六烷吡啶反應(yīng)1 小時，酶標(biāo)儀572 nm處測量吸光度。

1.3.7 兔關(guān)節(jié)外移植物-骨愈合模型建立

PET 韌帶剪成10 mm×5 mm 長方形，實驗組材料進(jìn)行Ce-CS修飾。兔子稱重后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，在股骨內(nèi)側(cè)髁處作一長約3 cm 的縱行切口，逐層分離、切開至關(guān)節(jié)囊，暴露股骨內(nèi)髁骨面，在內(nèi)側(cè)髁中部用直徑2 mm克氏針鉆一深度約10 mm 的孔，將韌帶卷成圓柱狀塞入骨缺損處，材料末端留約2 mm長度，然后逐層縫合、關(guān)閉切口。同一只兔子左、右側(cè)對照，左側(cè)為對照組，右側(cè)為Ce-CS 處理組。術(shù)后肌肉注射青霉素50 萬U/只，連續(xù)3天，正常飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)。

1.3.8 Micro-CT和三維重建分析

韌帶植入8 周后，處死動物，取出雙側(cè)股骨，去除周圍肌肉和軟組織，進(jìn)行Micro-CT掃描，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，分析兩組骨缺損處新骨再生情況。

1.3.9 組織學(xué)染色

取材后的股骨經(jīng)4%多聚甲醛固定后，依次進(jìn)行脫鈣、脫水、石蠟包埋，然后切片，進(jìn)行Masson、HE 染色。染色完成后的切片在顯微鏡下觀察、拍照，分析韌帶-骨界面的愈合情況。

1.3.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS22.0 和Graphpad 7 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)采用x ± s表示，采用t檢驗對組間差異進(jìn)行比較。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表面SEM、EDS檢測及接觸角實驗

如圖1 所示，PET 韌帶浸泡5 min 后，表面出現(xiàn)少量材料附著（B1）；15分鐘后，材料表面出現(xiàn)片狀附著物（C1）；浸泡30 分鐘后表面涂層達(dá)到飽和狀態(tài)，韌帶表面形成一層表面略粗糙的薄膜（D1），而對照組PET韌帶表面光滑（A1）。EDS 結(jié)果顯示，對照組表面僅有C、O兩種元素，而處理過的韌帶表面除了C、O，還出現(xiàn)了Ca、Si和Ce元素。經(jīng)Ce-CS凝膠振蕩浸泡處理30分鐘后，涂層材料達(dá)到飽和狀態(tài)，PET 表面形成均一、穩(wěn)定的涂層，為有效減少涂層組內(nèi)差異，遂將浸泡處理30分鐘的PET材料作為實驗組進(jìn)行體內(nèi)外實驗。接觸角實驗結(jié)果顯示：Ce-CS 修飾的材料表面親水性能明顯提升（圖2）。

2.2 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

如圖3（A）所示，隨著培養(yǎng)時間延長，各組細(xì)胞吸光值（OD）逐漸升高；在細(xì)胞培養(yǎng)1 天時，兩組OD 值無明顯差別；培養(yǎng)第3天和第7天時，Ce-CS組OD值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 ALP活性檢測

如圖3（B）所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)7 天、14 天后，Ce-CS組ALP活性均高于對照組（P＜0.05）。提示Ce-CS涂層能夠促進(jìn)rBMSCs細(xì)胞成骨分化。

2.4 成骨基因表達(dá)

如圖4 所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 天時，OCN 表達(dá)水平在兩組間的表達(dá)有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），COL-1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異；誘導(dǎo)培養(yǎng)14 天時，OCN、COL-1 在兩組間的表達(dá)均有明顯的差異（P＜0.01，P＜0.05）。

2.5 茜素紅染色

如圖5所示，Ce-CS組中礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯多于對照組，與對照組相比，Ce-CS組中的礦化結(jié)節(jié)顆粒更大。定量分析結(jié)果顯示兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明了Ce-CS可以有效的促進(jìn)rBMSCs細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)的形成。

圖1 材料表面SEM、EDS檢測結(jié)果

圖2 接觸角實驗結(jié)果

圖3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性結(jié)果（A）和ALP活性測定結(jié)果（B）

圖4 誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14天后，OCN、COL-1表達(dá)情況

圖5 誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后茜素紅染色（A、B）和茜素紅染色定量分析結(jié)果（C）

圖6 股骨Micro-CT掃描及三維重建圖片

圖7 BV/TV、BMD統(tǒng)計分析結(jié)果

2.6 Micro-CT和三維重建分析

CT 掃描圖片（圖6 A1-A4，B1-B4）顯示，本實驗成功建立了關(guān)節(jié)外移植物-骨愈合模型，實驗形成的骨缺損均一、一致，可以對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。三維重建結(jié)果（圖7）表明，右側(cè)骨缺損處新生骨體積高于左側(cè)，骨礦密度（BMD）左側(cè)為0.21 ± 0.02g/cm3，右側(cè)為0.36± 0.04 g/cm3，兩側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相對骨體積（BV/TV）左側(cè)為9.04% ± 3.77%，右側(cè)為23.30% ± 4.05%，兩側(cè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.7 組織學(xué)染色結(jié)果

Masson、HE 染色圖片可見，對照組韌帶與骨界面之間有較多纖維組織形成，沒有明顯的新生骨生成；Ce-CS 組有不同程度的新生骨形成，移植物與骨接線模糊，無明顯分界（圖8）。

圖8 HE染色結(jié)果（A、B）和Masson染色結(jié)果（C、D）

3 討論

ACL 重建是目前治療ACL 斷裂損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。ACL 重建的目的是恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，使患者恢復(fù)正常的體育運(yùn)動和活動，降低骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率[8]。理想的移植物需要具備材料容易獲得、與人體骨組織相容性好、生物力學(xué)穩(wěn)定以及術(shù)后斷裂并發(fā)癥少等特點，同時能夠滿足部分病人個體化差異的需求[29]。與自體和同種異體移植物相比，PET 韌帶能夠提供術(shù)后即時的抗拉伸強(qiáng)度，恢復(fù)快，無疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險。LARS 韌帶是我國運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前應(yīng)用最廣泛的人工合成韌帶，其生物力學(xué)性能良好，病人能夠早期恢復(fù)體育運(yùn)動，在臨床中取得了令人滿意的治療效果[30]。然而，LARS 韌帶主要成分是疏水性的PET 材料，與人體組織的生物相容性差，植入人體后容易誘發(fā)炎癥反應(yīng)，不利于細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化，影響移植物與宿主骨之間的愈合[31]。研究發(fā)現(xiàn)，在PET 韌帶表面進(jìn)行涂層修飾后，移植物的表面疏水性能和生物相容性得到明顯改善[15，32]，移植物在動物體內(nèi)的骨整合性能明顯增強(qiáng)[33]。

硅酸鈣是一種具有良好生物活性的生物陶瓷材料。CS釋放出來的鈣離子和硅離子不僅在表面磷灰石層形成過程中發(fā)揮著重要作用[20]，還可以直接影響成骨細(xì)胞代謝，促進(jìn)骨整合[15]。此外，在CS中摻入金屬元素可以進(jìn)一步改善其生物活性。金屬鈰具有良好的抗氧化、抗炎和促進(jìn)血管再生等生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，金屬鈰可以通過減少誘生型一氧化氮合酶和細(xì)胞內(nèi)超氧岐化酶的生成，清除自由基，從而發(fā)揮抗氧化作用。Chen 等[34]研究表明，即使在較高濃度水平（50 μg/ml）下，Ce也不會引起明顯的炎癥反應(yīng)，這在組織工程領(lǐng)域具有重要意義[35]。Ce 可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)水平，促進(jìn)血管的再生[36]，而損傷組織的修復(fù)和再生恰恰高度依賴新生血管的形成。納米氧化鈰制備的生物支架對人BMSCs沒有細(xì)胞毒性，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的成骨分化和膠原蛋白的生成[37]。Li[38]等通過等離子噴涂技術(shù)制備了含氧化鈰的（CeO2）的硅酸鈣涂層，并研究了該涂層對BMSCs和RAW264.7 巨噬細(xì)胞系的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該涂層能夠增強(qiáng)細(xì)胞的活性，促進(jìn)BMSCs 細(xì)胞的黏附、增殖、ALP 的活性以及礦化結(jié)節(jié)的生成，這些作用隨CeO2含量的增加而增強(qiáng)。

Zhang等[28]在硅酸鈣材料中加入5 mol%、10 mol%的CeO2制備了含CeO2的介孔硅酸鈣生物支架，結(jié)果表明加入CeO2后，材料的降解速率減慢，生物活性明顯提升，10 mol%組支架的各項性能優(yōu)于5 mol%組，但差異沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。前文也提及有文獻(xiàn)報道含CeO2硅酸鈣材料的生物活性隨CeO2含量的增加而增強(qiáng)，因此，本研究制備了含10 mol%鈰的硅酸鈣（Ce-CS）修飾的PET人工韌帶，并通過體外細(xì)胞實驗和動物實驗研究了該涂層的生物活性和生物相容性。結(jié)果表明，Ce-CS 能很好地粘附在PET韌帶表面，并在PET韌帶表面形成一層均勻的、表面略粗糙的薄膜，該方法相對簡便、可控。Ce-CS 修飾后的PET 韌帶親水性能明顯提升，更有利于細(xì)胞的黏附、增殖，SEM 結(jié)果也證實了這一點。我們通過CCK-8檢測了Ce-CS對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間延長，各組細(xì)胞吸光值（OD）逐漸升高，在培養(yǎng)第3天和第7天時，Ce-CS組OD值均高于對照組（P＜0.05），表明Ce-CS 可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。ALP是細(xì)胞成骨分化的早期標(biāo)志物。我們的研究結(jié)果表明，Ce-CS 能夠明顯促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP 活性（P＜0.05）。成骨相關(guān)基因OCN、COL-1在Ce-CS 組表達(dá)均高于對照組。此外，本研究還通過茜素紅染色分析了Ce-CS 對細(xì)胞外基質(zhì)礦化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Ce-CS 組細(xì)胞外礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量更多，礦化結(jié)節(jié)更大，定量分析表明兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述研究結(jié)果表明，Ce-CS可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化。但是，Ce-CS能否在體內(nèi)促進(jìn)移植物與骨之間的愈合，我們通過建立兔關(guān)節(jié)外移植物-骨愈合模型加以驗證。Micro-CT結(jié)果顯示，植入Ce-CS 修飾過韌帶的一側(cè)新骨形成量要多于對照側(cè)，兩側(cè)的BMD、BV/TV差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Masson 和HE 染色表明Ce-CS 組有不同程度的新生骨形成，移植物與骨界面之間的間隙變窄，對照組韌帶與骨界面之間有較多纖維組織形成，沒有明顯的新生骨生成，這與Micro-CT結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究證實含鈰硅酸鈣材料能夠均勻地粘附在PET 韌帶表面，方法簡便、可控；修飾的PET 韌帶能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化，體內(nèi)實驗驗證了含鈰硅酸鈣具有促進(jìn)移植物-骨愈合作用，為涂層修飾韌帶在臨床中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。