田 力，劉 波，彭朝勝，夏 菁，呂貫廷

結直腸癌是目前世界上常見的惡性消化道腫瘤之一，每年大約有50萬患者死于結直腸癌[1-2]。在我國常見惡性腫瘤中，結直腸癌死亡率在男性中居第五位，女性中居第六位[3]。隨著我國居民飲食和生活習慣的改變，近二十年來結直腸癌的發(fā)病率在逐漸升高[4]。肝轉移是結直腸癌主要的死亡原因之一[2]，約20%的結直腸癌患者在確診的同時發(fā)現(xiàn)有肝轉移，40%的結直腸癌患者在確診后一段時間后出現(xiàn)肝轉移，如不及時治療，結直腸癌肝轉移患者生存5～10個月的比例為50%，2年生存率僅為3%[5]，由此可見腫瘤轉移是控制結直腸癌的關鍵。

ZBTB18(又被稱為ZNF238、RP58、TAZ-1和C2H2-171)是一種含有C2H2型鋅指結構的蛋白，可抑制腦細胞內(nèi)相關的基因表達，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，該基因的突變會導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，ZBTB18在腦瘤中的高表達可顯著抑制腫瘤的生長，具有腫瘤抑制因子的作用[9-10]。

然而ZBTB18在結腸癌中的作用尚不明確。為了研究ZBTB18是否在結直腸癌中發(fā)揮腫瘤抑制的功能，我們從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中下載腫瘤基因表達譜數(shù)據(jù)，對ZBTB18在結直腸癌中的表達水平進行分析，并在具有不同轉移水平的結直腸癌細胞系中的表達進行檢測，同時結合Transwell實驗來分析ZBTB18在結直腸癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料 從NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)公共數(shù)據(jù)庫中下載人基因表達譜數(shù)據(jù)GSE1035129[11]。該數(shù)據(jù)集包括了65個乳腺癌組織及10個對照組織、57個結直腸癌組織及12個對照組織、60個非小細胞肺癌組織及9個對照組織和60個前列腺癌組織及7個對照組織，以上樣本使用Affymetrix HT-U133plus-2-PM芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)進行檢測。我們從GSE1035129數(shù)據(jù)中，收集結直腸癌樣本中ZBTB18的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

1.2 細胞系 結直腸癌細胞系DLD1、HCT116、HCC2998、SW480、HCT115、KM12、HT29、COLO205和SW620購自于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心或美國全球生物資源中心。采用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。

1.3 ZBTB18短發(fā)夾RNA慢病毒表達載體的構建 通過Ambion網(wǎng)站，針對ZBTB18 mRNA序列(NM_205768)設計了3組短發(fā)夾RNA(short-hairpin RNA，shRNA)，以便從中篩選得到最優(yōu)的序列(表1)。把shRNA-F(Foward)和shRNA-R(Reverse)等量混合后，置于沸水中，讓其緩慢降至室溫進行復性，短暫離心后置于4 ℃保存；將pLKO.1-puro慢病毒載體用限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI進行酶切及膠回收；把復性的shRNA雙鏈與酶切處理的pKLO.1-puro質(zhì)粒進行連接，連接反應用DNA ligation kit(6022Q，Takara)進行，具體操作參考試劑盒說明書。連接成功的質(zhì)粒進行Sanger測序鑒定并制備慢病毒。

表1 ZBTB18 shRNA核酸序列

1.4 熒光定量PCR檢測 利用SYBR Green PCR Master Mix(4309155，Applied Biosystems)通過ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Waltham,MA,USA)來進行定量PCR檢測，檢測引物見表2。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參，每個樣品做3個平行，陰性對照中cDNA模板以三蒸水代替。采用ΔΔCt法作相對定量，計算出目的基因在不同細胞中表達量的相對比率。其中Ct值指的是目的基因的量達到域值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)，因此Ct值越大則模板量越小。相對表達量的計算根據(jù)下列公式：Ratio=2-ΔΔCt=2-[ΔCt(sample)-ΔCt(control)]。其中ΔCt=Ct(ZBTB18)-Ct(GAPDH)，以此除去起始模板量所引起的差異。

表2 熒光定量PCR檢測引物

1.5 Transwell細胞侵襲及遷移實驗 用4 ℃預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/mL，在Transwell細胞培養(yǎng)板的chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel，37 ℃溫育30 min使其成膠狀；把細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整濃度為2×105/mL；在下室加入600～800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，上室加入200 μL細胞懸液，繼續(xù)在37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)12 h；取出chamber，吸干上室液體，用甲醇室溫固定30 min；加入約800 μL蘇木精染液,室溫染色30 min；取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；顯微鏡下取9個隨機視野計數(shù)，統(tǒng)計結果。細胞遷移實驗不需鋪Matrigel，其他步驟相同。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13和GraphPad Prism 5軟件進行處理，基因在結直腸癌組織和正常對照組織中的差異表達使用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌中ZBTB18表達數(shù)據(jù)分析 通過對NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)公共數(shù)據(jù)庫中結直腸癌樣本表達芯片數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)ZBTB18在結直腸癌組織樣本中的表達水平顯著高于正常組織(P=0.000 99,圖1A)。進一步分析ZBTB18在結直腸癌中的表達量，挑選了9種不同的結直腸癌細胞系(表3)，其中7種為原發(fā)性結直腸癌細胞系，2種為轉移性結直腸癌細胞系。用定量PCR檢測不同結直腸癌細胞系中ZBTB18的表達量。結果發(fā)現(xiàn)，在轉移性結直腸癌細胞系中，ZBTB18的表達水平高于原發(fā)性結直腸癌細胞，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P=0.021 5，圖1B)，提示ZBTB18與結直腸細胞轉移能力正相關。

圖1 ZBTB18結直腸癌組織及不同的腸癌細胞系中的表達水平

細胞系分化情況DLD1原發(fā)性腸癌HCT116分化差的原發(fā)性腸癌HCC2998分化較好的原發(fā)性腸癌SW480原發(fā)性腺癌HCT15初中度分化的腸癌KM12中度分化的腸癌HT29分化差的原發(fā)性腸癌COLO205轉移的腸腺癌SW620淋巴結轉移的腸腺癌

2.2 shRNA對ZBTB18的沉默 成功構建了3組針對ZBTB18的shRNA質(zhì)粒，利用慢病毒包轉質(zhì)粒感染HT29細胞，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定干擾ZBTB18表達的細胞系，利用定量PCR及半定量PCR檢測設計的3組shRNA對ZBTB18表達的影響。結果表明，3組shRNA都顯著降低了ZBTB18的表達，尤其shRNA1與shRNA3的影響更加明顯(圖2)。

A:定量PCR檢測shRNA對ZBTB18的沉默效果；B:半定量PCR檢測shRNA對ZBTB18的沉默效果圖2 shRNA對ZBTB18表達的沉默效果

2.3 ZBTB18沉默后對結直腸癌細胞侵襲和遷移的影響 利用Transwell實驗對pLKO.1-ZBTB18-shRNA3穩(wěn)轉的HT29細胞的遷移和侵襲能力進行分析。結果顯示，當ZBTB18沉默后，HT29細胞的遷移和侵襲有顯著的降低(P<0.05，圖3)。

圖3 Transwell實驗結果

3 討論

腫瘤轉移是涉及多基因變化的一系列復雜過程，包括腫瘤從原發(fā)部位脫落，進入血管淋巴，粘附于內(nèi)皮細胞，誘導血管生成對抗宿主，在遠端部位增殖形成轉移灶，整個過程受到許多基因的調(diào)控。與腫瘤轉移相關的基因可以分為腫瘤轉移促進基因及腫瘤轉移抑制基因，目前認為，腫瘤轉移相關基因的激活或腫瘤轉移抑制相關基因的失活均可導致腫瘤細胞性狀發(fā)生轉變而發(fā)生轉移[12-13]。研究表明，至少有10余種癌基因可誘發(fā)或促進腫瘤細胞的轉移能力，如MYC[14]、KRAS[15]、BRAF[16]、FES[17]、FMS[18]、WWOX[19]等，相對的轉移抑制基因主要包括參與細胞生理活動調(diào)節(jié)的NM23[20]、PTEN[21]、TIMP1[22]等。

ZBTB18蛋白在正常腦組織中高表達，但在腦瘤呈低表達，增加ZBTB18的表達水平則可抑制腫瘤的生長[10]。在腦膠質(zhì)瘤中，ZBTB18基因的啟動子被異常甲基化，導致其表達沉默；ZBTB18的缺失可調(diào)控預后不良相關基因的表達，促進膠質(zhì)母細胞瘤出現(xiàn)侵襲表型[9]。目前有關ZBTB18的研究主要集中于腦發(fā)育方面。ZBTB18基因的功能缺失性突變(錯義突變和拷貝數(shù)缺失)可導致腦新皮層和海馬發(fā)育不良、皮層成熟神經(jīng)元數(shù)量減少以及由于皮質(zhì)板內(nèi)神經(jīng)元的異常遷移而導致的層狀組織缺陷為主要特征的1q43q44微缺失綜合征[7-8,23]。

然而ZBTB18基因在其他組織和腫瘤中的功能研究尚未明確。我們通過對NCBI GEO公共數(shù)據(jù)庫中結直腸癌樣本表達芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ZBTB18在結直腸癌樣本中高表達，與正常對照樣本相比具有顯著差異，這一發(fā)現(xiàn)提示，ZBTB18可能在不同的癌癥中發(fā)揮著不同的作用。隨后在不同的結直腸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)，高轉移性腸癌細胞中ZBTB18的表達水平要顯著高于原發(fā)性腸癌(P=0.021 5)。當把ZBTB18表達水平敲低后，HT29細胞的侵襲和轉移能力均顯著降低。這表明，在腸癌細胞系中，ZBTB18的功能與腦膠質(zhì)瘤相反，具有促進腫瘤的功能，為癌基因。而該基因在結直腸癌中的作用機理還需進一步詳細研究，為結直腸癌及其他癌癥提供重要線索和依據(jù)。