劉秋晨 唐藝萍 宋夏

[摘要]目的 探討TNIP1基因沉默對系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者B細胞上BCR和CD40基因表達的影響。方法 收集2018年3月武漢大學醫(yī)院接收的20例SLE患者和20例健康體檢者的血液標本，以慢病毒介導(dǎo)TNIP1基因沉默為切入點，采用實時熒光定量PCR方法檢測細胞中的TNIP1基因中mRNA的表達水平以及BCR、CD40的表達水平。結(jié)果 TNIP1基因在SLE患者中的表達量較高，干擾B細胞中TNIP1基因可導(dǎo)致B細胞中BCR和CD40表達下調(diào)。結(jié)論 TNIP1、BCR和CD40基因在B細胞中的表達具有一致的表達趨勢，提示TNIP1、BCR、CD40有一定的調(diào)控關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]系統(tǒng)性紅斑狼瘡；B淋巴細胞；TNIP1；基因沉默

[中圖分類號] R758.62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（c）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the effect of TNIP1 gene silence on the expression of BCR and CD40 gene in B cells of patients with systemic lupus erythematosus （SLE）. Methods Blood samples from 20 SLE patients and 20 healthy subjects received in Wuhan University Hospital during March 2018 were collected. Lentiviral-mediated TNIP1 gene silence was used as an entry point. Real-time quantitative PCR was used to detect mRNA expression level as well as expression levels of BCR and CD40 in TNIP1 gene in cells. Results The expression level of TNIP1 gene was higher in SLE patients， and interference with TNIP1 gene in B cells could lead to down-regulation of BCR and CD40 expression in B cells. Conclusion The expression of TNIP1， BCR and CD40 genes in B cells show a consistent trend， suggesting that TNIP1， BCR and CD40 have a certain regulatory relationship.

[Key words] Systemic lupus erythematosus； B lymphocytes； TNIP1 gene； Gene silence

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種多發(fā)于青年女性的累及多臟器的自身免疫性炎癥性結(jié)締組織疾病。在遺傳因素、環(huán)境因素等各種因素相互作用下，導(dǎo)致T淋巴細胞減少、B淋巴細胞非正常增生、T抑制細胞功能降低，產(chǎn)生大量的抗體和自身抗原相互結(jié)合形成一種免疫復(fù)合物，引起機體的多系統(tǒng)損害[1]。具體表現(xiàn)有關(guān)節(jié)通、關(guān)節(jié)炎、皮膚病、胸腔積液、神經(jīng)系統(tǒng)受累、心肌炎、腎病綜合征等疾病，而其中45%以上的SLE患者臨床上有腎臟病變[2]。本研究旨在探討TNIP1（TNFAIP3-interacting protein1）基因沉默對SLE患者B細胞上BCR和CD40基因表達的影響，以期為SLE的發(fā)病機制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取武漢大學醫(yī)院風濕免疫科門診2018年3月收治的20例SLE患者和20例健康體檢者（無SLE家族史；近期無感染病史）。排除標準：妊娠、哺乳期和月經(jīng)期的婦女；凝血出血病史和出血傾向；心臟休克史，心室梗死，心肺復(fù)蘇。本研究中所有個體參與者獲得知情同意，所有人員均自愿加入本研究，血樣的采集等相關(guān)操作符合武漢大學醫(yī)學院的醫(yī)學倫理審查。所有參與者在空腹情況下抽取靜脈血10 ml供研究所用。

1.2實驗儀器與試劑

實驗儀器：低溫高速離心機（Eppendorf，德國）；磁力分選柱（Miltenyi Biottc公司LS Columns，德國）；NanoDrop 2000分光光度計（Thermo公司，美國）；PCR擴增儀（Eppendorf公司Mastercycle，德國）；實時熒光定量PCR儀（ABI 7500 Sequence Detection System，美國）。

實驗試劑：人外周血淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque（北京索來寶生物技術(shù)有限公司）；CD19抗體的免疫分選磁珠（德國美天旎）；RNA提取試劑盒（武漢塞維爾科技公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工生物有限公司）；RT-PCR試劑盒（上海生工生物有限公司）；瓊脂糖、溴酚藍、溴化乙錠（美國Sigma公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 293T細胞的培養(yǎng) 將培養(yǎng)基（10%血清、100 U/ml雙抗青鏈霉素）和PBS放于37℃水浴鍋中預(yù)熱，將已長到80%～90%的293T細胞培養(yǎng)瓶從37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中取出，用無菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基，加5 ml的預(yù)熱PBS洗滌1次，吸凈PBS，準備轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。

1.3.2質(zhì)粒提取 參照Omega公司的質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行操作。

1.3.3病毒包裝 將293T細胞原先的培養(yǎng)基抽吸掉，然后轉(zhuǎn)為6 ml的無雙抗，無胎牛血清的純DMEM培養(yǎng)基，再放入恒溫培養(yǎng)箱中待用。將TNIP1-siRNA（設(shè)置為干擾組）、pLKO.1（設(shè)置為對照組）及包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G以3∶1的比例進行細胞轉(zhuǎn)染。即取兩只新的1.5 ml的EP管，分別加入2 μg TNIP1-siRNA、2 μg包裝質(zhì)粒（1500 ng psPAX2和500 ng pMD2.G）和2 μg pLKO.1和2 μg包裝質(zhì)粒，再分別加入200 μl純DMEM培養(yǎng)基。取12 μl羅氏轉(zhuǎn)染試劑于300 μl的純培養(yǎng)基（10%血清、100 U/ml雙抗青鏈霉素）中，常溫靜置6 min。將轉(zhuǎn)染的試劑稀釋液加入DNA稀釋液中，于室溫靜置20 min后，將混勻的物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，6 h后補加10%胎牛血清（600 μl），1%雙抗（60 μl）。分別收集48、72、96 h的細胞上清液，再用0.22 μm的過濾器過濾后放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4外周血淋巴細胞的分離 向新鮮的血液中加入同等體積的PBS，顛倒混均。取10 ml離心管向里面分別加入提前預(yù)熱至室溫的與混合后相同體積的細胞分離液。室溫、2000 r/min離心20 min。拿出一只新的10 ml離心管，用移液槍將吸出的淋巴細胞層轉(zhuǎn)移進去，再加滿PBS溶液，使PBS溶液與淋巴細胞充分混合均勻。將上述10 ml離心管進行離心，1500 r/min離心20 min。取出離心管，可現(xiàn)離心管底部有沉淀。用抽濾泵將上層液體抽濾掉只剩沉淀。

1.3.5免疫磁珠標記和分選外周血CD19+ B淋巴細胞 在通過磁力架的外磁場中，CD19+ B淋巴細胞則被吸附在磁場中停留，而其他無該表面抗原的細胞不能與磁珠上的單抗特異性結(jié)合則不能停留在磁場中，達到分離的效果。

1.3.6 B淋巴細胞感染 各取1 ml新鮮的1640培養(yǎng)基分別加入到上述只有CD19+ B淋巴細胞的15 ml離心管中，充分吹打混合均勻。將上述混合均勻的兩管培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到8孔培養(yǎng)板中，只選4個孔用，每個孔中加入500 μl上述混合后的培養(yǎng)基，即2個孔為健康體檢者，2個孔為SLE患者。健康體檢者和SLE患者的2孔中分別各加入500 μl TNIP1-siRNA、pLKO.1病毒液，再分別加入1 μl能增加病毒感染力的poly-brene（終濃度為6 μg/ml）。將培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中感染24 h。24 h后取出培養(yǎng)板，將每個孔中的混合液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，1600 r/min，離心10 min。取出離心管，去上清，每只離心管中加入500 μl新鮮的1640培養(yǎng)基，充分吹打混合均勻。將上述混合均勻的4只離心管中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的8孔培養(yǎng)板中。

1.3.7外周血淋巴細胞總RNA提取 參照omega公司的RNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.3.8反轉(zhuǎn)錄cDNA合成 參照試劑盒，按照說明書操作，合成cDNA?；蚪MDNA去除反應(yīng)體系（表1）和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（表2）。體系配好后置于PCR擴增儀中設(shè)置程序為42℃，2 min；4℃，hold。體系配好后繼續(xù)置于PCR擴增儀中設(shè)置程序為37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，hold；-20°C保存。

1.3.9 RT-PCR檢測TNIP1基因在B淋巴細胞中的表達 合成TNIP1引物：根據(jù)GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）登錄（登錄號BC014008.1）得TNIP1基因序列（表3）；應(yīng)用Primer Permier 5.0軟件和NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）上的序列比對功能設(shè)計qRT-PCR引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)：根據(jù)RT-PCR試劑盒操作說明書配制，按表4成分配置每管20 μl的體系。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火45 s，共35個循環(huán)，72℃加長延伸10 min。

1.4統(tǒng)計學方法

ΔΔCt法：A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內(nèi)標基因，待測樣本）、B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標基因，對照樣本）、K=A-B表達倍數(shù)=2-K。計算后再進行定量分析，其中用β-actin基因的轉(zhuǎn)錄水平進行校準。采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料兩組間比較進行t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異顯著，P<0.001為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1 TNIP1、β-actin、BCR及CD40基因溶解曲線和擴增曲線

首先檢測TNIP1、β-actin、BCR和CD40的qRT-PCR引物質(zhì)量，圖1A（封四）顯示，所設(shè)計引物溶解曲線波形陡直，四個引物無雜峰，提示用于實驗的引物有效，質(zhì)量較好，而且擴增產(chǎn)物單一，因此該引物可以用于檢測TNIP1基因的表達情況。圖1B（封四）顯示，四個基因的擴增曲線，三個復(fù)孔的重復(fù)性好，提示實驗操作中復(fù)孔之間的差異小，操作所引起的實驗誤差很小。

2.2 qRT-PCR檢測TNIP1 mRNA的表達水平

qRT-PCR檢測TNIP1沉默后mRNA的表達水平，結(jié)果顯示，健康體檢者和SLE患者干擾組（TNIP1-siRNA）的TNIP1 mRNA表達水平均顯著低于對照組（pLKO.1）的TNIP1 mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.001）（圖2A）。提示慢病毒介導(dǎo)的基因沉默的效率較高，成功地使TNIP1基因在B細胞中轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。同時通過分析健康體檢者和SLE患者的TNIP1表達，結(jié)果顯示，TNIP1在SLE患者中的表達量較高（圖2B），提示TNIP1的表達異常升高可能是SLE發(fā)病的一個因素。

2.3 qRT-PCR檢測BCR和CD40 mRNA的表達水平

進一步分析了TNIP1基因沉默后B細胞活化標志分子BCR和CD40的mRNA的表達水平，結(jié)果顯示，BCR的表達在健康體檢者中下調(diào)表達差異不明顯，但在SLE患者中表達差異明顯（P<0.001）（圖3A）；無論是SLE患者還是健康體檢者，隨著TNIP1基因的下調(diào)，干擾組（TNIP1-siRNA）的CD40表達水平低于對照組（pLKO.1）的CD40表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）（圖3B）。提示BCR、CD40基因和TNIP1基因是同步下調(diào)的，干擾B細胞中TNIP1基因可導(dǎo)致B細胞中BCR和CD40表達下調(diào)，進一步提示TNIP1基因表達水平與BCR和CD40的表達存在某種相關(guān)性。

3討論

目前，SLE確切病因不明，是各種因素綜合作用的結(jié)果，目前認為該病是在遺傳基礎(chǔ)上，某些特定的因素如環(huán)境因素，藥物、食物、細菌病毒感染等導(dǎo)致SLE的發(fā)生。其中，遺傳因素是使SLE疾病發(fā)生的重要因素，研究表明，SLE發(fā)病具有家族聚集傾向[3]。但是各種環(huán)境因素，如環(huán)境污染在SLE的發(fā)病中起到促進作用。SLE是一種復(fù)雜的多基因性遺傳病。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究及多項候選基因研究（genome-wide association study，GWAS）分析法分析諸多SLE患者后發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)的TNIP1基因表達異常等[4]，在對SLE的發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)易感基因的出現(xiàn)幫助人類在基因組層面更加深刻了解到SLE疾病，報道并證實了TNIP1為我國漢族人群SLE發(fā)病新的易感基因，提示TNIP1基因在調(diào)控自身免疫性炎癥形成方面具有重要作用[5]。迄今為止SLE尚無根治的方案，只能控制病情惡化，延長生命。SLE病多侵犯育齡期女性，其發(fā)病及患病率在性別、區(qū)域及種族上存在較大差異性[6]。

TNIP1即腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3）的相互作用蛋白1，在1999年第1次被克隆出來[7]，是一種新型的內(nèi)源性炎癥調(diào)控因子，參與免疫功能的調(diào)節(jié)[8]。人類TNIP1基因位于染色體5q32-q33.1，cDNA基因長度1911 bp，有18個外顯子，外顯子1為非編碼外顯子[9]。研究認為TNIP1基因rs7708392位點的突變與SLE的發(fā)生有很大關(guān)系[10]，而另有研究認為TNIP1基因rs7708392位點突變與SLE發(fā)病無關(guān)[11]。綜上，TNIP1基因rs7708392位點的突變與SLE發(fā)病的關(guān)系仍存在爭議。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，TNIP1基因與免疫系統(tǒng)的關(guān)系密切[12]，分布于很多神經(jīng)、肌肉、免疫系統(tǒng)等，特別是在免疫系統(tǒng)的胸腺、骨骼肌、血液中表達活躍，而在大腦中低表達[13]。TNIP1在過表達的條件下，可以抑制腫瘤壞死因子、白細胞介素1等從而誘導(dǎo)NF-κB的活性來發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能[14]。

BCR是B細胞抗原受體，具有抗原結(jié)合特異性，同一個體內(nèi)，BCR的多樣性很高，可以組成容量巨大的BCR庫[14]，同時可以幫助個體識別各種各式抗原、產(chǎn)生特異性抗體[15]。BCR可直接識別完整的、天然的蛋白質(zhì)抗原、多糖或脂類抗原[16]。BCR與抗原作用時有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞增殖信號可引起機體免疫應(yīng)答，而轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞凋亡信號會引起免疫耐受。這兩者的異常則可引起機體免疫應(yīng)答缺陷或自身免疫[17]。

CD40是B細胞的一種表面抗原，具有抗原結(jié)合特異性，分子量為48KD，CD40為Ⅰ型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11-2g13-2[18]，屬腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員[19]。在很多細胞中均有表達，如B細胞、上皮細胞和一些腫瘤細胞系[20]。CD40的信號傳導(dǎo)途徑在不同細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)是不一樣的，正向調(diào)節(jié)可導(dǎo)致細胞增殖或分化，負調(diào)節(jié)則可導(dǎo)致細胞抑制和凋亡，CD40的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過調(diào)節(jié)非受體型酪氨酸蛋白激酶來達成。CD40是SLE疾病領(lǐng)域研究中重要的分子之一[21]。

本研究采用病例對照分析的方法，運用實時熒光定量PCR的方法，把SLE患者的外周血淋巴細胞中TNIP1基因與健康體檢者的表達情況進行比較，結(jié)果顯示，SLE患者的表達情況與健康體檢者相比是上調(diào)的，可能TNIP1基因的表達上調(diào)會減少炎癥因子的釋放，TNIP1基因在活化的B細胞中特異性高表達。SLE患者中的B淋巴細胞的數(shù)目較多，也有可能是B細胞數(shù)目的增多導(dǎo)致了TNIP1基因的上調(diào)，TNIP1上調(diào)具有自身保護性。

干擾SLE患者及健康體檢者B細胞中的TNIP1基因，可以導(dǎo)致健康體檢者和SLE患者中的TNIP1 mRNA表達情況均明顯下調(diào)，干擾成功。RNA干擾B細胞中TNIP1基因?qū)е翨細胞上的BCR和CD40表達同步下調(diào)。綜上，TNIP1、BCR和CD40基因在B細胞中的表達具有一致的表達趨勢，提示TNIP1、BCR、CD40有一定的調(diào)控關(guān)系，TNIP1基因可能通過調(diào)節(jié)受體后信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)影響B(tài)CR和CD40介導(dǎo)的信號途徑和BCR和CD40基因的表達，進而對B淋巴細胞在SLE免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響作用。TNIP1基因與SLE的發(fā)病機制有明顯的相關(guān)性。

BCR和CD40均是B淋巴細胞的抗原受體，具有特異性結(jié)合，與SLE的發(fā)病機制和機理有關(guān)。采用病毒介導(dǎo)TNIP1基因的方式導(dǎo)入B淋巴細胞中，有效沉默B細胞TNIP1基因，觀察對B細胞中的BCR和CD40 mRNA表達情況的影響。結(jié)果顯示，BCR、CD40的表達和TNIP1同步下調(diào)，提示TNIP基因的表達情況會影響B(tài)CR和CD40基因的表達，TNIP1具有調(diào)節(jié)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，可能通過某種分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑這種方式，或者TNIP1調(diào)控B細胞活性，而BCR、CD40與B細胞活性相關(guān)，但具體的影響機制并不清楚。維持B細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定性需要如BCR、CD40等多種細胞表面受體的整合。TNIP1基因的表達會影響B(tài)CR和CD40的表達，使患者的炎癥減輕，改善免疫反應(yīng)，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)等。

綜上所述，TNIP1、BCR和CD40基因在B細胞中的表達具有一致的表達趨勢，提示TNIP1、BCR、CD40有一定的調(diào)控關(guān)系。

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（收稿日期：2018-10-29 本文編輯：任秀蘭）