吳亮，山順林

作者單位：1蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，安徽 蚌埠 233000；2解放軍82醫(yī)院腫瘤中心，江蘇 淮安 223001

原發(fā)性肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，其中 80%～85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。我國惡性腫瘤發(fā)病率及病死率占第1位的均是肺癌[2]。具有發(fā)病率高、發(fā)病機制復(fù)雜、早期難以發(fā)現(xiàn)，治療效果不佳等特點。腫瘤標(biāo)志物有助于早期診斷肺癌，對早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有重要作用。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，在初診時，57%的病人已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，因此發(fā)現(xiàn)新的有價值的生物學(xué)標(biāo)志物檢測方法對于早期診斷肺癌，預(yù)測疾病發(fā)展，快速評估療效顯得十分重要[3]。

穿刺活檢標(biāo)本雖然能明確有無腫瘤及其類型，但是有創(chuàng)傷性，而且由于肺癌的位置和大小、腫瘤組織的異質(zhì)性、活檢組織的滯后性，有不易反映腫瘤整體狀態(tài)，不易隨時監(jiān)測，多次活檢依從性差等缺點。正是存在這些缺點,液體活檢技術(shù)在腫瘤的早期監(jiān)測顯示出明顯的技術(shù)優(yōu)勢，被MIT Technology Review(麻省理工科技評論)雜志公布為2015年度十大突破技術(shù)的榜單，液體活檢位列其中，成為當(dāng)下研究熱門領(lǐng)域[4]。液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術(shù)，具有無創(chuàng)傷性，標(biāo)本容易獲得，可以反映腫瘤整體狀態(tài)，實現(xiàn)實時監(jiān)測的優(yōu)點，有助于腫瘤微轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后評估，在治療監(jiān)測，個體化治療發(fā)揮重要價值。基于精準(zhǔn)醫(yī)療已經(jīng)成為腫瘤診療過程的熱點，液體活檢是指從體液中獲得來源組織的生物標(biāo)志物，并通過對所得標(biāo)志物分析來反映其來源組織相關(guān)信息[5]。液體活檢項目包括循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA),外泌體(Exosomes),小核糖核酸miRNA等，其中CTCs與ctDNA發(fā)展最為迅猛。目前液體活檢主要應(yīng)用領(lǐng)域是腫瘤的血液檢測，即利用血液提示腫瘤發(fā)展進程及抗藥性等信息，指導(dǎo)個體化精準(zhǔn)治療。

目前，CTCs、ctDNA和外泌體是現(xiàn)在最主流的液體活檢技術(shù)，表1對這三種技術(shù)做了簡單的歸納。

表1 液體活檢的分類

從技術(shù)角度上，隨著新一代的測序技術(shù)，ctDNA的檢測變得最為容易，也是液體活檢領(lǐng)域發(fā)展最快的分支，外泌體是本身理化性質(zhì)的原因，分離難度最大，CTCs因為包含整個細胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組是液體活檢領(lǐng)域臨床研究最為深入。

1 CTCs

1.1 CTCs作為潛在標(biāo)志物的研究進展CTC在1869年被澳大利亞病理學(xué)家John Ashworth發(fā)現(xiàn)，是指在實體腫瘤發(fā)生過程中，有少量的細胞從原生腫瘤脫離進入血液，隨血液循環(huán)到達新的定植器官，繼而形成新的轉(zhuǎn)移灶[6]。1960年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)多個CTC聚集在一起的CTC簇。而隨著1994年Cellsearch系統(tǒng)的研發(fā)成功，大量的臨床實驗展現(xiàn)了CTC在癌癥預(yù)后復(fù)發(fā)效用上的應(yīng)用[7]。

目前CTCs是罕見的可以預(yù)測多種腫瘤預(yù)后的細胞，這些循環(huán)細胞通過不同技術(shù)進行檢測，其分析被稱為對病人的實時“液體活檢”。CTCs具有廣闊前景，在技術(shù)上仍然具有很大的挑戰(zhàn)性，尤其是關(guān)于CTC富集和分析技術(shù)，已先后出現(xiàn)膜過濾法、免疫熒光染色、RT-PCR等，這些技術(shù)的不斷革新提高了從海量血細胞中獲取CTC的準(zhǔn)確度和對后續(xù)分析提供支持，也是這項技術(shù)的臨床應(yīng)用成為可能。Dorsey等[8]研究中指出在成功檢測CTCs數(shù)量的NSCLC病人中，放療后病人血清CTCs數(shù)量減少和腫塊的大小減小相一致，表明CTCs可以作為放療療效的評測指標(biāo)。很多研究表明，很多腫瘤直徑即使在2～4 mm的情況下已經(jīng)有腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移進入血液循環(huán)，從這個角度，CTCs檢測技術(shù)對于腫瘤的早期診斷具有重要意義。研究通過Cellsearch技術(shù)檢測早期未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤病人(根據(jù)腫瘤的類型)CTC細胞的比率非常低，利用同樣的技術(shù)，Ilie等[9]對長期吸煙的慢性阻塞性肺疾病病人進行CTC細胞測定，定期復(fù)查最終診斷為肺癌的病人發(fā)現(xiàn)CTCs。CTCs對于腫瘤的早期診斷方面有至關(guān)重要的作用，在Fiorelli等[10]的研究中,CTCs計數(shù)>25可以幫助從良性病變病人中區(qū)分肺癌的異常肺部成像。

1.2 CTCs臨床應(yīng)用進展臨床分期是病人制定相關(guān)治療方案的依據(jù)。目前基于影像學(xué)檢測結(jié)果和通過腫瘤的病灶侵犯深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況來判斷病人的臨床分期，不能準(zhǔn)確判斷腫瘤病灶血液微轉(zhuǎn)移情況對病人治療及預(yù)后的影響。液體活檢技術(shù)檢測CTCs可以很好地彌補這一缺陷，對病人的臨床分期做出有效的評估。Krebs等[11]研究101例未經(jīng)任何治療Ⅳ期NSCLC病人，發(fā)現(xiàn)治療前CTC計數(shù)水平與腫瘤分期具有顯著相關(guān)。Nicolazzo等[12]對24例Ⅳ期NSCLC參與PD-1/PD-L1抑制劑治療的病人，發(fā)現(xiàn)CTCs及其PD-L1的表達與病人的不良反應(yīng)結(jié)果相關(guān)。說明PD-L1陽性CTCs可能成為抗PD-1定向治療的預(yù)測性腫瘤標(biāo)志物。

1.3 CTCs的臨床局限性雖然CTCs技術(shù)已經(jīng)表現(xiàn)出很強的診斷和預(yù)測腫瘤治療有效性的的作用,CTCs同時具有局限性，CellSearch和其他的技術(shù)使用上皮組織標(biāo)志物并不能發(fā)現(xiàn)所有的CTCs，因此依賴單細胞測序技術(shù)的發(fā)展，同時腫瘤細胞具有異質(zhì)性，CTCs細胞并不能完全代表實體腫瘤，這些問題都需要在臨床上亟待解決[13]。

2 ctDNA

2.1 ctDNA作為潛在標(biāo)志物的研究進展ctDNA是指腫瘤細胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，源于腫瘤細胞的雙鏈DNA,主要存在血液，滑膜腔積液，腦脊液等體液中，外周血游離DNA的大小約為160～190 bp，其長度大約為50 nm。循環(huán)DNA的表現(xiàn)應(yīng)該更具有特異性，隨著基因測序的飛速發(fā)展，目前，已能在血液中對其進行檢測并計數(shù)。它的發(fā)現(xiàn)追溯到循環(huán)游離DNA(cfDNA)，cfDNA是由體細胞釋放入外周血循環(huán)后發(fā)生降解的內(nèi)源性DNA。ctDNA可以通過多種方式進入血液中，比如：分泌、吞噬作用以及凋亡壞死[14]。Qiu等[15]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA提供了一種微創(chuàng)和可行的方法檢測EGFR突變的NSCLC(NSCLC)。ctDNA的分析將是NSCLC個體化治療一個重要組成部分。Nie等[16]指出，基因突變、基因甲基化等均可在NSCLC病人ctDNA中發(fā)現(xiàn)，ctDNA可以用來檢測NSCLC，同時對于腫瘤的異質(zhì)性，ctDNA檢測腫瘤變異比CTCs有更高的敏感性和特異性。Marchetti等[17]從37例非小細胞癌病人中抽取血液樣本利用CellSearch系統(tǒng)結(jié)合二代測序技術(shù)(NGS)進行研究，檢測到ctDNA中EGFR基因突變和對應(yīng)腫瘤組織檢測結(jié)果31例，提示液體活檢結(jié)果為病人EGFR基因突變產(chǎn)生并為病人提供個體化治療提供重要的參考依據(jù)。

2.2 ctDNA臨床應(yīng)用進展很多科學(xué)研究表明ctDNA可以準(zhǔn)確預(yù)測病人的預(yù)后，美國約翰霍普金斯大學(xué)發(fā)明BEAMing擴增法，大大提高ctDNA的檢測敏感性。通過將循環(huán)DNA與磁珠結(jié)合進行計數(shù)，可以實現(xiàn)萬分之一的檢測靈敏度。此外數(shù)字化PCR技術(shù)也逐漸應(yīng)用于ctDNA基因檢測。數(shù)字PCR技術(shù)是一種新型的高靈敏性的核酸片段分析技術(shù)。Chen等[18]收集了58例早期NSCLC病人的配對血液和組織標(biāo)本，采用靶向測序技術(shù)檢測配對的腫瘤血漿ctDNA標(biāo)本的基因突變狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿檢測ctDNA突變狀態(tài)，與組織標(biāo)本具有較高的一致性，且比不同腫瘤標(biāo)志物具有更高的敏感性。表明ctDNA可以作為判斷腫瘤的預(yù)測因子。Rosell等[19]通過ctDNA分析180例晚期NSCLC病人的EGFR和KRAS的突變狀態(tài)，其中120例病人診斷時時分析ctDNA，而60例病人在出現(xiàn)對EGFR-TKIs耐藥性時分析了ctDNA。結(jié)果顯示對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人而言，ctDNA分析是檢測EGFR和KRAS突變的有效方式。最新研究表明，ctDNA中腫瘤特異性突變和CTC計數(shù)相比，在判斷預(yù)后ctDNA方面展現(xiàn)非常明顯的優(yōu)越性。

2.3 ctDNA的臨床局限性不同病人不同時間測定外周血中ctDNA水平差異很大，受清除速度、血容量、腫瘤的分期分級等因素影響較大。此外基于現(xiàn)代的檢測技術(shù)digital PCR，標(biāo)記擴增深度測序技術(shù)、分光光度法提高靈敏性,血液標(biāo)本中ctDNA量少，與腫瘤組織相比，可靠性穩(wěn)定性尚需進一步驗證。

3 Exosomes

3.1 Exosomes作為潛在標(biāo)志物的研究進展Exosomes 來源廣泛，淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞及上皮樣細胞、腫瘤細胞等都可以分泌外泌體。這些細胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑約為40～100 nm，具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，其攜帶有母細胞多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等重要信息，在細胞和細胞間的物質(zhì)交換和信息傳遞起到重要作用[20]。外泌體含有大量的蛋白質(zhì)，主要分為兩類：一類是外泌體固定蛋白，另一類是與細胞來源和組織類型相關(guān)性的特異性蛋白。此外，外泌體含有大量的遺傳信息mRNA和miRNA，對外泌體研究最多的是具有功能活性的miRNA成分。最近的研究表明，這些外泌體可以作為標(biāo)志物，來檢測疾病的進展，甚至在病人出現(xiàn)臨床癥狀前做出腫瘤診斷、預(yù)后判斷、療效評估。腫瘤來源的Exosomes促進腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移和耐藥[22]。目前對于外泌體的分離提純方法包括高速離心法，密度梯度離心法，色譜法，超濾膜過濾離心法等[23]。NSCLC病人的Exosomes中包含的腫瘤相關(guān)蛋白有EGFR、KARS、claudins、RAB家族蛋白等。Alos等[24]對8例化療前的NSCLC病人的外泌體進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)特異性高表達的蛋白條帶，還發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤組織中也存在該蛋白高表達，提示高表達的特異性蛋白條帶可能來源原發(fā)腫瘤組織，可作為NSCLC潛在的腫瘤標(biāo)志物。

3.2 Exosomes的生物學(xué)功能肺癌發(fā)生和發(fā)展是一個多步驟的過程，涉及分子基因水平的變化，肺癌的發(fā)病過程仍有很多未解之處。NSCLC通過與腫瘤微環(huán)境相互作用介導(dǎo)腫瘤的增殖和侵襲。Al-Nedawi等[25]發(fā)現(xiàn)NSCLC 外泌體可將突變的EGFR 轉(zhuǎn)移到腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮生長因子的表達分泌，從而促進內(nèi)皮細胞增殖。Wang等[26]研究表明，NSCLC 外泌體中的TGF-β和IF-10 也參與調(diào)控細胞的增殖轉(zhuǎn)移，其高水平表達可促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Rahman 等[27]通過將具有侵襲性和不具有侵襲性的肺癌細胞外泌體分別作用于受體細胞進行對比研究，發(fā)現(xiàn)高度侵襲性肺癌外泌體可誘導(dǎo)受體細胞表達與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的波形蛋白，并可能通過波形蛋白來驅(qū)動受體細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而獲得侵襲和遷移能力。另外，NSCLC 外泌體中的miRNA 也廣泛參與NSCLC 侵襲-轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控[28]。

3.3 Exosomes的臨床局限性NSCLC外泌體的研究有重要的臨床意義，但是很多問題需要解決，外泌體的miRNA的表達受到很多因素影響，特異性和靈敏性不高，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的提純外泌體的方法，在分離和純化外泌體的過程還有很多問題需要進一步解決，腫瘤組織和外泌體的miRNA存在一定差異性[29]。在臨床上不能廣泛的應(yīng)用。

4 展望

早期檢測是癌癥研究和治療的關(guān)鍵，液體活檢是一項富有挑戰(zhàn)的新技術(shù)，在腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中扮演越來越重要的角色，隨著檢測標(biāo)準(zhǔn)化的日益發(fā)展，檢測靈敏度的提高，以及新的生物標(biāo)志物的問世，液體活檢將成為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實時療效檢測手段，臨床應(yīng)用價值極其顯著。大量研究進一步證實，液體活檢技術(shù)檢測在腫瘤細胞中數(shù)量與腫瘤發(fā)生、療效、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有著密切的關(guān)系，通過外周血對腫瘤細胞的檢測，有助于腫瘤的早期診斷，療效的快速評估，個體化治療，預(yù)后判斷和腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測。

隨著腫瘤基因組分型系統(tǒng)和精準(zhǔn)治療的臨床廣泛應(yīng)用和推廣，本文側(cè)重描寫了當(dāng)前熱門的CTCs，ctDNA，miRNA，外泌體技術(shù)在NSCLC中的研究進展，目前液體活檢行業(yè)仍處于早期階段，真正進入臨床但仍有很多問題亟待解決，著力開發(fā)高特異性和靈敏性的檢測技術(shù)是進一步臨床的前提，建立檢測標(biāo)準(zhǔn)，還需得到臨床實踐的認可，在檢測技術(shù)不斷創(chuàng)新的同時，相信液體活檢技術(shù)會成為未來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)趨勢。