趙麗娟 - 李 倩 李晨陽(yáng) - 徐 芳 趙 軍

(1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2. 新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830004)

天山堇菜是堇菜科堇菜屬多年生草本植物，以全草入藥，主要分布于海拔3 000 m以上的天山山區(qū)[1-2]。該藥材可水煎或泡茶使用，氣味微苦，具有清熱祛風(fēng)、解毒消腫的療效，主要用于發(fā)燒、頭痛、咽痛、小兒驚厥等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[3]表明天山堇菜具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等多種生物活性，其化學(xué)成分包含香豆素、黃酮、生物堿、皂苷和揮發(fā)油等，其中秦皮乙素是其主要的標(biāo)識(shí)性成分。秦皮乙素又名七葉內(nèi)酯、6,7-二羥基香豆素，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和保肝等多種生物活性[4]。對(duì)天山堇菜秦皮乙素的研究?jī)H限于其含量測(cè)定及抗腫瘤活性篩選研究[3,5]，其提取純化工藝尚未見(jiàn)報(bào)道。大孔樹(shù)脂具有吸附容量大、吸附速度快、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于醫(yī)藥食品行業(yè)中有效成分純化中[6-8]。因此，為了天山堇菜及其成分秦皮乙素的開(kāi)發(fā)，本試驗(yàn)擬以秦皮乙素含量為指標(biāo)，建立天山堇菜秦皮乙素大孔樹(shù)脂純化工藝，以獲得富含秦皮乙素的提取物，同時(shí)分析其吸附動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特征，為天山堇菜進(jìn)一步研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天山堇菜：批號(hào)160601，亳州市華云中藥飲片有限公司；

秦皮乙素對(duì)照品：批號(hào)110741-201708，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

HPD100A、HPD400、HPD500、HPD750、NKA、X-5、D101、AB-8型大孔吸附樹(shù)脂：天津南開(kāi)大學(xué)化學(xué)廠；

甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-10ATvp型，日本島津公司；

電子天平：AL204型，美國(guó)梅特勒—托利多儀器有限公司；

超聲清洗機(jī)：AS10200AD型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

小型粉碎機(jī)：ST-02A型，永康市帥同工具有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-B型，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 天山堇菜提取液的制備 準(zhǔn)確稱取石油醚脫脂粉碎后的天山堇菜藥材360 g，以30倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，用水反復(fù)混懸溶解過(guò)濾，濾液定容至600 mL，即得樣品溶液，測(cè)定秦皮乙素的濃度，備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取秦皮乙素對(duì)照品0.008 6 g，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得濃度為0.172 0 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.3.3 樹(shù)脂的預(yù)處理 稱取HPD100A、HPD400、HPD500、HPD750、NKA、X-5、D101和AB-8型樹(shù)脂適量，加入95%乙醇，浸泡24 h，裝柱，梯度乙醇洗脫至洗脫液和水混合不出現(xiàn)白色渾濁為止，用蒸餾水洗至無(wú)醇味，備用。

1.3.4 天山堇菜秦皮乙素的測(cè)定 色譜柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1% 磷酸水溶液—甲醇(體積比70∶30)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm；進(jìn)樣量10 μL。精密量取對(duì)照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，搖勻后HPLC測(cè)定，以峰面積對(duì)秦皮乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=14 955X+14 853，r=0.999 5，線性范圍3.44～137.60 μg/mL。

1.3.5 不同型號(hào)樹(shù)脂的篩選 分別稱取0.5 g處理好的各種型號(hào)樹(shù)脂于25 mL具塞錐形瓶中，加入供試品溶液稀釋成0.206 8 mg/mL的溶液10 mL，25 ℃水浴恒溫振蕩器(頻率為120 r/min)中振搖吸附24 h，過(guò)濾，各取10 μL 按1.3.4測(cè)定秦皮乙素濃度。抽干樹(shù)脂表面水分，加入95%乙醇溶液10 mL，相同條件下振搖24 h，各取10 μL 測(cè)定秦皮乙素含量，分別按式(1)、(2)計(jì)算吸附率和解吸率。

(1)

(2)

式中：

R1——吸附率，%；

R2——解析率，%；

C0——吸附前秦皮乙素濃度，mg/mL；

C1——吸附后秦皮乙素濃度，mg/mL；

C2——解析液中秦皮乙素濃度，mg/mL；

V1——樣液體積，mL；

V2——解析液體積，mL。

大孔樹(shù)脂的特性如表1。

1.3.6 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 稱取最佳樹(shù)脂5.0 g于250 mL 具塞錐形瓶中，加入供試品溶液稀釋成0.103 4 mg/mL 的溶液100 mL后，置于120 r/min，溫度298 K恒溫振蕩器中振蕩吸附12 h。分別于0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0 h吸取0.5 mL上清液，并通過(guò)HPLC測(cè)定秦皮乙素濃度，按式(3)計(jì)算樹(shù)脂的吸附量，并繪制HPD500對(duì)秦皮乙素的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

(3)

表1 大孔吸附樹(shù)脂的物理性質(zhì)

式中：

R3——吸附量，mg/g；

C0——吸附前秦皮乙素濃度，mg/mL；

C1——吸附后秦皮乙素濃度，mg/mL；

V1——樣液體積，mL；

m——樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.3.7 吸附等溫線和吸附熱力學(xué) 分別稱取最佳樹(shù)脂0.5 g 置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入10 mL濃度為0.051 7，0.103 4，0.155 1，0.206 8，0.258 5，0.310 2，0.361 9，0.413 6 mg/mL系列溶液，分別在298，308，318 K 恒溫振蕩器中以120 r/min振搖24 h，使其達(dá)到吸附平衡，測(cè)得不同溫度下的吸附等溫線，并計(jì)算樣品的平衡濃度、大孔樹(shù)脂的平衡吸附量。

1.3.8 大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附與解析試驗(yàn)

(1) 上樣濃度的影響：分別稱取5份HPD500樹(shù)脂10.0 g裝入玻璃柱(φ20 mm×500 mm)(各因素考察均以此法裝柱)，以2.0 mL/min的流速各加入濃度為0.866 2(50 mL)，1.732 5(25 mL)，2.593 5(16.7 mL)，3.464 9(12.5 mL)，4.331 2(10 mL) mg/mL的提取液，用7 BV水洗脫，測(cè)定秦皮乙素含量并計(jì)算吸附量。

(2) 最大上樣量的選擇：以2.0 mL/min的流速將濃度為2.593 5 mg/mL樣液緩緩加入樹(shù)脂柱中，每10 mL收集一流份，測(cè)定流出液中秦皮乙素的含量，以考察樹(shù)脂的最大吸附量。

(3) 上樣流速的確定：以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min的流速分別加入2.593 5 mg/mL樣液30 mL，用7 BV水洗脫，測(cè)定秦皮乙素含量并計(jì)算吸附量。

(4) 除雜用水量的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入2.593 5 mg/mL溶液30 mL充分吸附，用水洗脫除雜，每一柱體積收集一流份，濃縮干燥，稱重。

(5) 洗脫劑濃度的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL溶液30 mL，上樣完成后，用7 BV蒸餾水除雜，再以10%，30%，50%，70%，95%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮干燥，按式(4)、(5)計(jì)算純度和回收率。

(4)

(5)

式中：

R4——回收率，%；

R5——純度，%；

M1——洗脫液中秦皮乙素含量，mg；

M2——上樣液中秦皮乙素含量，mg；

M3——濃縮干燥后質(zhì)量，g。

(6) 洗脫劑用量的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL溶液30 mL，用7 BV蒸餾水除雜，再以50%乙醇洗脫，每一個(gè)柱體積收集一個(gè)流份，測(cè)定含量，繪制洗脫曲線。

(7) 洗脫流速的確定：以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL溶液30 mL，用7 BV蒸餾水洗脫除雜，再用7 BV 50%乙醇以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min流速洗脫，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。

(8) 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按最佳條件以2.0 mL/min的流速分別加入濃度為2.593 5 mg/mL樣液30 mL，平行3份，然后用7 BV蒸餾水除雜，再用7 BV 50%乙醇以2.0 mL/min流速洗脫，收集50%乙醇洗脫液，計(jì)算回收率和純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同型號(hào)大孔樹(shù)脂的篩選

樹(shù)脂的吸附量受被吸附物質(zhì)的特性、樹(shù)脂的比表面積、孔結(jié)構(gòu)及極性等因素影響?？讖叫〉臉?shù)脂有利于吸附分子質(zhì)量較小的物質(zhì)，HPD500樹(shù)脂孔徑5.5～7.5 nm，在所篩選8種樹(shù)脂中最小，秦皮乙素為小分子化合物(相對(duì)分子量為178.14)。由表2可知，HPD500樹(shù)脂對(duì)天山堇菜秦皮乙素有較好的吸附與解吸附效果，吸附率和解吸率分別達(dá)到了87.76%，86.82%。因此，選擇HPD500樹(shù)脂為該化合物純化的最佳樹(shù)脂。

表2 不同型號(hào)大孔樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的吸附與解吸附情況

2.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

溶質(zhì)在溶液體系中進(jìn)行吸附時(shí)，溶劑、溶質(zhì)對(duì)吸附劑進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，假設(shè)溶劑的吸附可忽略時(shí)，吸附體系可用單組分吸附來(lái)處理。靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線顯示了吸附劑對(duì)溶質(zhì)的吸附量隨時(shí)間的變化過(guò)程[9]。如圖1所示，5 h內(nèi)HPD500樹(shù)脂的吸附量不斷增加；5 h后，HPD500樹(shù)脂的吸附量已基本保持平衡。因此，HPD500樹(shù)脂對(duì)天山堇菜秦皮乙素的吸附時(shí)間為5 h。

2.3 HPD500樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的吸附動(dòng)力學(xué)模型

大孔樹(shù)脂對(duì)有效成分的吸附為物理過(guò)程，主要通過(guò)范德華力或者氫鍵進(jìn)行。為闡明吸附機(jī)理，分別將擬一級(jí)、擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型應(yīng)用于結(jié)果的分析討論中[10]。

圖1 298 K時(shí)HPD500樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的靜態(tài) 吸附動(dòng)力學(xué)曲線

擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的表達(dá)式：ln(qe-qt)=lnqe-k1t，

(6)

通過(guò)取對(duì)數(shù)變換為qt=qe(1-e-k1t)，

(7)

(8)

式中：

qt——某一時(shí)間的吸附量，mg/g；

qe——平衡吸附量，mg/g；

k1——擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的速率常數(shù)；

k2——擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的速率常數(shù)。

以qt為縱坐標(biāo)對(duì)t作圖，可判斷反應(yīng)是否符合擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律并求得反應(yīng)系數(shù)k1。

以t/qt對(duì)t作圖，可判斷反應(yīng)是否符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律并求得反應(yīng)系數(shù)k2。

由表3可知，擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程能更好地描述HPD500樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的吸附過(guò)程，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。

進(jìn)一步用粒子擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)Kannan方程(qt=k3t0.5+C，式中k3，C為常數(shù))分析結(jié)果，以t0.5為橫坐標(biāo)，qt為縱坐標(biāo)，擬合動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)[11]。由表3可知，粒子擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)Kannan方程不適合描述整個(gè)吸附過(guò)程，吸附速率的控制步驟除顆粒內(nèi)擴(kuò)散外，可能還存在邊界層擴(kuò)散和液膜擴(kuò)散等其他吸附作用。

表3 HPD500型大孔樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素吸附量的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 靜態(tài)吸附熱力學(xué)考察

由圖2可知，隨著秦皮乙素質(zhì)量濃度增加，吸附等溫線逐漸趨于平緩。隨著溫度的升高，qe降低，表明低溫有利于吸附，HPD500樹(shù)脂吸附秦皮乙素是個(gè)放熱過(guò)程。

等溫吸附模型的擬合常用Langmuir和Freundlich方程[12]。Langmuir模型為單分子層吸附過(guò)程，假定吸附劑的表面分布是均勻的、且吸附物之間無(wú)相互作用，該模型比較適合解釋單層吸附，即吸附作用僅發(fā)生在吸附劑的外表面。Freundlich模型不僅能用于單層吸附，還能用于不均勻表面的吸附情況，能很好地解釋試驗(yàn)結(jié)果。

圖2 HPD500型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的 吸附等溫線

(9)

(10)

式中：

qe——平衡吸附量，mg/g；

Ce——平衡濃度，mg/mL；

qm——飽和吸附量，mg/g；

KL——Langmuir常量；

KF、n——Freundlich常數(shù)。

由表4可知，隨著溫度的升高，KF，KL，qm都降低，表明此吸附為放熱過(guò)程，低溫有利于吸附。Freundlich方程的相關(guān)系數(shù)R2接近于1，說(shuō)明HPD500樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的等溫吸附更符合該方程，也說(shuō)明秦皮乙素在HPD500上的吸附是非均勻的多層吸附。n>1，說(shuō)明該吸附為“優(yōu)惠吸附”，具有較強(qiáng)的吸附能力。

2.5 吸附熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

吸附熱力學(xué)參數(shù)包括吸附焓變(△H)、吸附自由能變(△G)和吸附熵變(△S)。按文獻(xiàn)[13-14]的方法計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)。等量吸附焓變△H和樹(shù)脂吸附量有密切關(guān)系，Van’t Hoff方程：

表4 兩個(gè)方程擬合參數(shù)

ln(1/Ce)=lnK0+(-△H/RT)，

(11)

式中：

K0——Van’t Hoff方程常數(shù)；

R——理想氣體常數(shù)8.314 J/(mol·K)。

△H按式(11)計(jì)算，以ln(1/Ce)對(duì)1/T作圖，通過(guò)擬合方程計(jì)算△H。

吸附自由能△G可通過(guò)Gibbs方程從吸附等溫線衍生計(jì)算得式(12)：

(12)

式中：

q——吸附量，mg/g；

x——溶液中吸附質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)。

(13)

將式(13)代入式(12)得式(14)：

△G=-nRT，

(14)

式中：

n——Freundlich方程中的參數(shù)。

說(shuō)明△G與吸附量q無(wú)關(guān)。

吸附熵△S按式(15)算：

Gibbs-Helmholtz方程：△S=(△H-△G)/T。

(15)

由表5可知，不同初始濃度下的△H均<0，表明吸附為放熱過(guò)程，與吸附等溫線得出的結(jié)論一致?！鱃均<0，說(shuō)明樹(shù)脂吸附秦皮乙素是自發(fā)的，且隨溫度的升高，△G逐漸增大，自發(fā)程度減小，升溫不利于吸附?！鱃和△H的絕對(duì)值分別<20、40 kJ/mol，說(shuō)明吸附為物理過(guò)程[15-16]?！鱏始終<0，說(shuō)明吸附后溶液體系的混亂程度降低，可能由于溶質(zhì)分子被吸附到樹(shù)脂表面上而導(dǎo)致溶質(zhì)分子在溶液中的自由度降低。

2.6 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附與解析

2.6.1 單因素試驗(yàn) 由圖3(a)可知，當(dāng)上樣濃度<2.593 5 mg/mL時(shí)，隨濃度的增大，吸附量逐漸增加；超過(guò)2.593 5 mg/mL時(shí)，吸附量下降。因此，選擇最適的上樣濃度為2.593 5 mg/mL。由圖3(b)可知，當(dāng)上樣體積為30 mL(即兩個(gè)柱體積，2 BV)時(shí)，有少量的秦皮乙素泄漏，

表5 HPD500樹(shù)脂吸附秦皮乙素的熱力學(xué)參數(shù)

圖3 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果

超過(guò)30 mL，出現(xiàn)大量泄漏。通過(guò)換算，確定最大上樣量為7.780 5 mg/g·樹(shù)脂。如圖3(c)所示，隨著流速的增大，吸附量不斷降低，秦皮乙素未被吸附就洗脫。上樣流速小，化合物能被樹(shù)脂充分地吸附。考慮時(shí)間成本因素，選擇上樣流速為2.0 mL/min。由圖3(d)可知，除雜用水量增加，所得雜質(zhì)的質(zhì)量明顯減少；達(dá)到7 BV時(shí)，雜質(zhì)的質(zhì)量變化很小，絕大部分雜質(zhì)已被洗脫下來(lái)。故選取7倍量的蒸餾水除雜。由圖3(e)可知，乙醇濃度越高，回收率較高，可能是由于秦皮乙素分子量小，脂溶性較大。乙醇濃度>50%時(shí)，其濃度越高，洗脫下的雜質(zhì)越多，純度也越低。故洗脫溶劑確定為50%乙醇。由圖3(f)可知，7 BV 的50%乙醇溶液可將秦皮乙素幾乎全部洗脫下來(lái)。故選擇7 BV的50%乙醇洗脫。如圖3(g)所示，洗脫流速過(guò)快，越不利于秦皮乙素的洗脫，其回收率逐漸減小。因此，選取2.0 mL/min為洗脫流速。

2.6.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在最佳條件下，秦皮乙素的平均回收率為93.32%，RSD為1.20%；平均純度為37.16%，RSD為0.56%，說(shuō)明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

HPD500樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素具有較高的吸附率和解吸附率；吸附過(guò)程符合Freundlich等溫方程，降溫有利于吸附；吸附是一個(gè)自發(fā)(G<0)、放熱(H<0)的物理過(guò)程。熵變S<0，表明吸附為熵減的過(guò)程；吸附動(dòng)力學(xué)符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，相關(guān)系數(shù)為0.999，能有效反映HPD500樹(shù)脂對(duì)秦皮乙素的吸附過(guò)程。動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果顯示，天山堇菜秦皮乙素上樣濃度2.593 5 mg/mL，最大上樣量7.780 5 mg/g·樹(shù)脂，上樣流速2.0 mL/min，除雜水量7 BV，7 BV 50%乙醇溶液洗脫，洗脫流速2.0 mL/min時(shí)，解吸率可達(dá)93.32%，所得提取物中秦皮乙素含量由上樣前的0.90%提高到37.16%，提高了41倍。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝成本低、簡(jiǎn)單易操作，適用于天山堇菜秦皮乙素的工業(yè)化大生產(chǎn)。后續(xù)可通過(guò)各種色譜技術(shù)進(jìn)一步探索建立從提取物中獲得高純度秦皮乙素的純化方法。