韓 智 王會霞 - 龔 蕾 朱曉玲 -曹 琦 王 彬 張 苗ZG

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430070；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

紅糖富含氨基酸、多酚類化合物、有機酸及微量元素，具有益氣養(yǎng)血、健脾暖胃、祛風散寒、活血化瘀等功效，深受中國人群特別是女性和老年人的青睞[1]。2016年，“新余市糖姑娘貿(mào)易有限公司疑似非法添加雌激素”事件把紅糖的食品安全推向風頭浪尖[2]，暴露出食糖存在的食品安全風險。雌性激素對維持女性正常生殖功能十分重要，具有促進性器官發(fā)育的功能，還能促進第二性征發(fā)育等。紅糖中添加雌性激素可能有緩解痛經(jīng)等功能，但有研究[3-4]表明過多的激素進入人體內(nèi)可能引起內(nèi)分泌失調(diào)，導致機體代謝紊亂，甚至導致腫瘤等疾病。歐盟等國際組織及國家均對動物源性食品中激素的殘留作出了嚴格的要求，中國也有相關(guān)法律法規(guī)[5]禁止一些激素在動物性食品中檢出。

近年來，激素的檢測技術(shù)得到國內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注，開發(fā)出的檢測方法準確度高、檢出限低，目前食品中激素殘留的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，GC-MS或HPLC分離一般需要衍生處理，過程較為繁瑣，激素具有沸點高、揮發(fā)性低的特點，一般不宜采用GC-MS法直接測定[6]。LC-MS/MS是目前激素檢測的主要方法，相關(guān)國家標準或行業(yè)標準也采用LC-MS/MS法，如GB/T 21981—2008、SN/T 1980—2007、SN/T 2533—2010，檢測對象為動物性食品及化妝品。而以食糖基質(zhì)為分析對象的相關(guān)研究少有報道，在“糖姑娘”[2]事件發(fā)生后，曾三妹等[6]利用LC-MS/MS檢測食糖中的雌二醇，樣品經(jīng)水溶解后，用堿化乙腈提取，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，HPLC-MS/MS檢測，雌二醇定量限為0.1 μg/kg。高裕鋒等[7]用乙腈提取紅糖樣品中的雌二醇，經(jīng)QuEChERs方法凈化，用HPLC-MS/MS檢測，雌二醇的檢出限為0.7 μg/kg。這些檢測方法的建立為食糖的食品安全監(jiān)管工作的開展提供一定的技術(shù)支持。相比于食糖基質(zhì)，肝腎組織[8]、水體[9-10]、水產(chǎn)[11]、飼料[12]、乳制品[13-14]等基質(zhì)已開發(fā)出同時檢測多激素殘留的方法，但食糖中僅有雌二醇的檢測方法。紅糖作為一款熱銷產(chǎn)品，深受消費者喜愛，但其安全問題不容忽視，特別是非法添加雌性激素問題值得關(guān)注。

本試驗擬對紅糖中可能非法添加的9種雌性激素為研究對象，包括4種雌激素(雌酮、己烯雌酚、雌二醇、雌三醇)，5種孕激素(醋酸甲羥孕酮、甲孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、孕酮)，建立同時檢測這9種物質(zhì)的方法，對已有檢測方法進行有效補充，旨在完善激素殘留檢測體系，并對實際樣品進行系統(tǒng)檢測，以期為食糖安全生產(chǎn)和健康風險的評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌酮(99.5%)、己烯雌酚(99.5%)、雌二醇(96.6%)、雌三醇(98.8%)、孕酮(99.2%)、甲孕酮(99.0%)、醋酸氯地孕酮(99.6%)、醋酸甲地孕酮(99.0%)、醋酸甲羥孕酮(99.0%)：德國Dr. Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈：HPLC級，美國Merck公司；

乙酸銨：HPLC級，美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級桿質(zhì)譜儀：Qtrap 6500型，美國ABSCIEX公司；

超高效色譜儀：Ultimate 3000型，美國Thermo Fisher公司；

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3型，100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters公司；

超純水器：Milli-Q型，法國密理博公司；

孔徑濾膜：0.22 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；

渦旋振蕩器：YALBOYS型，上海安譜科學儀器有限公司；

高速離心機：Avanti JXN 30 型，美國Beckman Coulter公司；

HLB固相萃取柱：60 mg，3 mL，美國Waters公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

氮吹儀：N-EVAP 116型，上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 相關(guān)溶液的配制

(1) 2 mmol/L乙酸銨溶液配制：準確稱取0.154 0 g乙酸銨，用超純水溶解，并定容至1 L。

(2) 標準溶液配制：孕酮、甲孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚用乙腈溶解并定容，配制成濃度為1 000 mg/L的標準儲備液；雌二醇、雌三醇、雌酮先用少許二甲亞砜溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成濃度為 1 000 mg/L標準儲備液。根據(jù)需要用50%乙腈—水溶液稀釋成不同濃度的混合標準工作液。標準儲備液均在-18 ℃冰箱中保存?；旌蠘藴使ぷ饕涸? ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品前處理 稱取紅糖樣品約2.0 g，于50 mL具塞離心管中加入8 mL水，渦旋振蕩使其充分溶解，加入8 mL 乙腈，渦旋5 min，加入1 g無水硫酸鈉，迅速振搖，渦旋振蕩1 min，以4 500 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移5 mL乙腈于15 mL離心管中，用氮吹儀在45 ℃下濃縮近干。加入體積分數(shù)為5%的甲醇—水溶液5 mL，渦旋混勻后通過HLB固相萃取小柱(經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水預(yù)活化)，保持流速約為1 mL/min，然后用3 mL超純水淋洗小柱。待淋洗液流盡，減壓抽干3 min，用4 mL甲醇洗脫，收集洗脫液在45 ℃下氮吹至干，加入1 mL初始流動相溶解殘留物，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液上機測定。

1.3.3 超高效液相色譜條件 色譜柱采用ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相A為乙腈，流動相B為 2 mmol/L乙酸銨水溶液，洗脫梯度為：0.0～1.0 min，B相保持70%，2.0～4.0 min，B相 70%～5%，4.0～7.0 min，B相保持5%，7.0～7.1 min, B相5%～70%，7.1～10.0 min，B相70%。柱溫35 ℃；進樣量2 μL；流速0.3 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，正負離子同時掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓5 500 V (ESI+)，4 500 V(ESI-)；離子源溫度300 ℃；氣簾氣壓力2.76×105Pa；碰撞氣壓力為中等(Medium)；霧化器壓力3.79×105Pa；輔助氣壓力3.44×105Pa；入口電壓10.0 V；碰撞室出口電壓10.0 V。表1為9種目標化合物的定性、定量離子對及最優(yōu)參數(shù)。

表1 9種化合物的質(zhì)譜參數(shù)?

? * 定量離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別配制質(zhì)量濃度為200 μg/L的9種雌性激素的標準溶液，采用針泵直接進樣方式進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚采用負離子獲得母離子，孕酮、甲孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮采用正離子掃描模式，對母離子施加合適碰撞能量，使其產(chǎn)生子離子，選取豐度強且干擾少的2對子離子，并優(yōu)化對應(yīng)離子對的去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)、碰撞室入口電壓(EP)。綜合所有離子對響應(yīng)信號優(yōu)化質(zhì)譜離子源溫度(TEM)、碰撞壓力(Collision gas, CAD)、氣簾氣壓力(Curtain gas, CUR)、霧化氣壓力(GS1)、去溶劑氣壓力(GS2)和離子源噴霧電壓(Ion spray voltage, IS)。優(yōu)化結(jié)果：TEM為300 ℃，CXP為10 V，EP為10 V，負離子模式IS為-4 500 V，正離子模式IS為5 500 V，CUR為2.76×105Pa，GS1為3.79×105Pa，GS2為3.44×105Pa，CAD為Medium。在最優(yōu)條件下，9種雌性激素的MRM圖如圖1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

流動相的組成對色譜峰形、分離度及靈敏度產(chǎn)生影響，LC-MS/MS分析中正離子模式通過添加甲酸，負離子通過添加氨水或易揮發(fā)緩沖鹽來提高離子化效率，通過改變流動相洗脫梯度來分離化合物。由于9種激素中無同分異構(gòu)體，且離子對相互無干擾，本試驗重點考察了水+乙腈、0.1%甲酸水溶液+乙腈、2 mmol/L乙酸銨+乙腈、水+甲醇、0.1%甲酸水+甲醇、2 mmol/L乙酸銨+甲醇作為流動相時，9種目標化合物離子對的響應(yīng)強度及色譜峰形。結(jié)果表明使用2 mmol/L乙酸銨+乙腈作為流動相時，9種激素的響應(yīng)最高，峰形尖銳且對稱。還考察了流速為0.2，0.3，0.4 mL/min時的色譜圖，發(fā)現(xiàn)0.4 mL/min 時峰形最尖銳，但系統(tǒng)壓力高，且靈敏度低于0.3 mL/min條件下的靈敏度，因此本試驗采用0.3 mL/min 流速。

2.3 樣品前處理優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 參考高裕峰[7]的方法，在空白紅糖中加標后考察不同試劑對目標激素的提取效果，試驗結(jié)果與其相同，使用乙腈提取效果較好，但存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。參考曾三妹等[6]的方法，先用水溶解紅糖，再用不同體積的乙腈提取，己烯雌酚回收率高于140%，雌三醇回收率低于60%，其他物質(zhì)回收率較好，因此繼續(xù)優(yōu)化提取條件。比較了體積分數(shù)為50%乙腈—水溶液作為提取劑時，添加不同質(zhì)量鈉鹽后的提取效果。往提取溶液中分別加入0.1，1.0，5.0 g的Na2CO3、Na2SO4、NaCl，渦旋振蕩1 min、4 500 r/min離心5 min，取上清液測定。結(jié)果表明使用1.0，5.0 g Na2SO4時回收率效果最好。

2.3.2 固相萃取條件的優(yōu)化 食糖的主要成分是蔗糖，含有較多色素[15]，這些色素會隨著目標化合物一起被提取出來，可能會干擾色譜分析，污染色譜柱和離子源，簡單有效的前處理顯得尤為重要，本試驗采用SPE方法對紅糖進行凈化。研究者[8,16]常采用HLB或C18固相萃取柱進行凈化不同基質(zhì)中的雌激素。與C18反相萃取柱相比，HLB固相萃取柱具有更好的穩(wěn)定性和廣泛的pH實用性，且凈化過程中柱體干涸對其影響不大，操作性更好，因此本試驗直接選用HLB進行凈化。在考察其凈化效果前，先驗證HLB固相萃取柱對9種激素柱回收率。在5 mL水中加入100 ng激素標準儲備液溶液，充分混勻，分別取3根固相萃取柱，每根柱上樣量為1 mL，經(jīng)過上樣、淋洗、洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干，乙腈—水復溶至1 mL，定量測定9種激素的含量，結(jié)果表明HLB柱對9種激素的回收率為98.8%～101.3%。在食糖中添加10 μg/kg的激素，采取1.3.2的方法進行前處理及上機測定，9種激素的回收率為92.2%～113.2%。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng) UPLC-MS/MS是獸藥殘留檢測常用的檢測方法，但缺點是可能存在基質(zhì)效應(yīng)，造成定量結(jié)果不準確。本試驗研究了紅糖中9種雌性激素的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明9種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均為80%～120%，可忽略不計，因此本試驗采用溶劑標準溶液直接進行定量分析。

圖1 9種激素的MRM圖

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性與檢出限及定量限 配制一系列質(zhì)量濃度的標準溶液在1.3的儀器分析條件下進行測定，以響應(yīng)為縱坐標，化合物質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制線性方程，得出9種物質(zhì)在一定線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均>0.99，以3倍信噪比確定目標化合物的檢出限，10倍信噪比確定目標物的定量限，結(jié)果見表2。

2.4.2 方法的回收率及精密度 按照定量限、2倍定量限、10倍定量限共3個質(zhì)量濃度水平對空白紅糖進行添加回收率試驗，每個添加水平平行測定6次，按照本方法進行檢測，計算平均回收率及標準偏差。如表3所示，4種雌激素平均回收率為 92.2%～113.2%，5種孕激素平均回收率為93.5%～105.6%，相對標準偏差均<10%，該方法的回收率和相對標準偏差均具有較好的準確度和精密度，滿足分析要求。

表39種激素的加標回收率及相對標準偏差

Table3Spikedrecoveriesandrelativestandarddeviations(RSDs)ofninehormones(n=6)

化合物名稱添加量/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%雌酮 3.098.34.56.097.83.230.099.74.2己烯雌酚 3.0113.25.86.0108.64.130.0103.22.6雌二醇 3.0101.55.16.099.44.530.098.06.0雌三醇 3.0101.55.16.099.44.530.092.26.0孕酮 0.6100.33.21.296.25.46.095.43.3甲孕酮 0.6105.11.91.2 102.33.46.0 99.35.6醋酸氯地孕酮0.698.22.51.293.56.56.0102.33.7醋酸甲地孕酮0.6105.66.81.2103.25.46.097.83.8醋酸甲羥孕酮0.6102.35.81.296.65.56.098.31.6

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

采用本試驗所建立的方法對網(wǎng)售及市售38種紅糖樣品進行檢測，9種激素均未檢出。

3 結(jié)論

本試驗建立了UPLC-MS/MS同時測定紅糖中4種雌激素和5種孕激素，方法簡便、快速，系統(tǒng)的方法學評價結(jié)果表明本方法靈敏度高、定量準確、回收率良好、操作簡便，能滿足日常紅糖中雌性激素的測定要求，但是該方法未覆蓋更多的性激素，今后應(yīng)在此研究基礎(chǔ)上進一步擴寬檢測激素的種類，完善激素殘留檢測體系，以期為食糖安全生產(chǎn)和健康風險的評價提供參考。