張 穎 何 健 王 濤 王 韌 陳正行CN -

(1. 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

糙米是稻谷經(jīng)脫殼得到的穎果，在適宜的濕度和溫度下，米胚處長出芽體，即為發(fā)芽糙米。發(fā)芽的實質(zhì)是糙米內(nèi)部多種酶活化的過程[1]，淀粉酶[2]、蛋白酶[3]等將大分子物質(zhì)分解成還原糖和游離氨基酸等物質(zhì)[4]，不僅為芽體的生長提供助力而且能大幅度增加益生成分，提升發(fā)芽糙米的抗氧化能力[5-6]和營養(yǎng)品質(zhì)[7]。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric Acid，GABA)是發(fā)芽糙米中最主要的功能性成分，具有提高腦活力、改善記憶、抗焦慮抑郁、緩解神經(jīng)緊張等生理功能[8-9]。谷物中GABA含量受到底物谷氨酸和谷氨酸脫羧酶(Glutamic acid decarboxylase，GAD)的共同限制。據(jù)報道，在糙米發(fā)芽過程中對糙米進行適當?shù)拇碳?，如金屬鹽脅迫[10-11]、低溫刺激[12]、厭氧脅迫[13]、水浸脅迫[14]等，能大幅度提高GABA含量，且GABA的富集程度與脅迫條件有較大的關(guān)系。陳志剛[15]的研究表明低濃度的Ca2+能提高遼粳294的發(fā)芽率，最適濃度為0.5 mmol/L，發(fā)芽3 d后芽長可達0.5 cm，但未研究GABA含量的變化情況。Wei等[10-11]的研究表明Fe2+和Zn2+能促進糙米的發(fā)芽，250，100 mg/L分別是最佳濃度，但Fe2+處理后GABA比未脅迫的發(fā)芽糙米低0.94%而Zn2+處理則提高82.8%。丁俊胄等[13]用N2和CO2營造厭氧環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CO2的促進效果明顯優(yōu)于N2，脅迫72 h后GABA可達965.44 mg/100 g。盡管脅迫的方式很多，但是目前對糙米發(fā)芽的脅迫處理大都只采用一種脅迫方式，而文獻[16-18]報道采用2種或2種以上處理的脅迫方式比單一脅迫對植物積累GABA更有效。雖然在蔣振輝[19]的研究中也有采用通氣和Ca2+脅迫，但是Ca2+的梯度設置少，只研究了1.5 L/min通氣量下0.5，2.5，10.0 mmol/L的氯化鈣溶液的影響，未對交互作用做詳細的探究。本試驗擬以鎮(zhèn)糯19號為脅迫工藝的研究對象，在研究單一脅迫處理(金屬離子脅迫、通氣脅迫)對糙米發(fā)芽效果和富集GABA含量的影響的基礎上，重點研究2種不同的脅迫處理對糙米的影響，優(yōu)化了雙重脅迫的處理方式和工藝條件，并以其他8種不同品種的糙米進行驗證，以期為糙米的深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

稻谷(來源與類型見表1)：2017年11月收獲，礱谷后的糙米經(jīng)過分級篩除雜和挑選后，于4 ℃避光保存；

無水氯化鈣、次氯酸鈉、無水乙酸鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

GABA標準品：中國百靈威公司；

鄰苯二甲醛(OPA)：生化試劑，美國Agilent公司；

衍生緩沖液：美國Agilent公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器與設備

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HHS-21-6型，上海博訊實業(yè)有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9030型，上海恒科學儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Series型，美國Agilent公司；

液相色譜柱：ZORBAX SB-Aq型，4.6 mm×150 mm，美國Agilent公司；

表1 9種稻谷類型及來源

氣泵：CT-202型，江蘇森森休閑用品貿(mào)易有限公司；

游標卡尺：530-108型，瑞士TESA公司。

1.2 方法

1.2.1 糙米萌發(fā) 稱取25 g糙米樣品(鎮(zhèn)糯19)，用體積分數(shù)0.5%的次氯酸鈉浸泡消毒30 min，再用去離子水清洗數(shù)遍。將洗凈瀝干的糙米移入帶有鐵絲網(wǎng)的燒杯，鐵絲網(wǎng)距杯底約1 cm，添加3～4倍體積的去離子水使去離子水液面略高于糙米，將燒杯置于30 ℃的水浴鍋中浸泡12 h后，在同樣條件下進行發(fā)芽，每隔12 h換水，并取樣測定發(fā)芽率、芽長和GABA含量，發(fā)芽結(jié)束后于50 ℃熱風干燥5 h。

(1) 通氣脅迫：將不同通氣量的氣泵泵頭置于鐵絲網(wǎng)與燒杯底部的空隙中，對浸泡液中鼓入新鮮的空氣，通氣量分別為0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 L/min，浸泡液為去離子水。對照樣設為去離子水浸泡發(fā)芽36 h且未通氣處理的發(fā)芽糙米。

(2) 金屬離子脅迫：選擇5種金屬離子浸泡液，分別為硫酸鋅、氯化鎂、氯化鈣、硫酸銅、硫酸鋁，濃度參見表2，其中低濃度分別參考了Wei等[11]和李曉丹等[20]的，高濃度為5倍低濃度，發(fā)芽時間為30 h。對照樣設為去離子水浸泡發(fā)芽36 h且未通氣處理的發(fā)芽糙米。

(3) 雙重脅迫：在確定通氣方式和金屬離子浸泡液種類的基礎上，以GABA含量為主要指標，優(yōu)化雙重脅迫萌

表2 5種金屬離子浸泡液的種類和濃度

發(fā)的工藝條件。對照樣設為去離子水浸泡發(fā)芽36 h且未通氣處理的發(fā)芽糙米。

1.2.2 芽長及發(fā)芽率的測定

(1) 芽長：參照GB/T 3543.4—1995，修改如下：隨機選取30粒發(fā)芽糙米籽粒，使用游標卡尺測定其長度，然后取平均值作為芽長。

(2) 發(fā)芽率：參照溫坤芳等[21]的方法，修改如下：取25 g 糙米樣品在一定條件下進行發(fā)芽試驗，發(fā)芽結(jié)束后確定發(fā)芽顆粒數(shù)和未發(fā)芽顆粒數(shù)并計算發(fā)芽率。

1.2.3 GABA含量的測定 參照張繼紅等[22]和李勇等[23]的方法采用柱前衍生法測定，其中GABA的測量使用紫外檢測器于388 nm處進行檢測，流動相A為0.04 mol/L 的乙酸鈉溶液(pH為7.2)，流動相B為甲醇—乙腈—水(體積比2∶2∶1)，洗脫時間38 min，柱溫40 ℃。

1.2.4 驗證實驗 分別選粳米、秈米各3種和糯米2種進行雙重脅迫萌發(fā)效果的驗證。浸泡液為35 mmol/L的氯化鈣溶液，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時間30 h。在發(fā)芽至21 h時進行通氣，通氣量為1.5 L/min，發(fā)芽30 h時停止通氣，共通氣9 h。發(fā)芽糙米樣品經(jīng)干燥后按照1.2.3方法測定GABA含量。以去離子水浸泡發(fā)芽36 h且未通氣處理的發(fā)芽糙米為對照樣。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復3次，結(jié)果以(平均值±標準差)表示。應用SPSS軟件進行方差分析，顯著性分析采用Ducan’s多重檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 通氣脅迫萌發(fā)

全程通氣處理對發(fā)芽糙米GABA含量和芽長的影響如圖1(a)、(b)所示。浸泡液為去離子水時，發(fā)芽糙米中GABA含量隨著通氣處理時間的變化呈不同的趨勢[圖1(a)]。發(fā)芽24 h之前，通氣脅迫萌發(fā)樣品的GABA含量略低于對照樣，可能是發(fā)芽初期糙米處于吸水復蘇階段，當吸水率達到糙米自重的15%～18%時開始發(fā)芽，30%時可正常發(fā)芽[24]。通氣向浸泡液中鼓入空氣(室溫)可能會降低浸泡液溫度(30 ℃)從而降低糙米的吸水速率。此外，通氣會增加水中溶解氧的含量，而未通氣的糙米在耗盡浸泡液中的氧氣后處于低氧環(huán)境，以無氧呼吸為主，糙米產(chǎn)生應激反應導致GAD活性更高[25]，有利于GABA的生成。發(fā)芽24 h的糙米吸水已達到飽和狀態(tài)，此時吸水速率降到最低，呼吸速率達到最高，通氣處理為芽體的生長提供充足的氧氣，芽體在延長過程中GABA大量生成。1.0 L/min通氣處理30 h的糙米GABA含量為24.24 mg/100 g，與對照相比提高15%。通氣量再增大，GABA含量反而有所下降。這表明，在發(fā)芽后期適當?shù)耐馓幚碛欣诓诿字蠫ABA含量的提高。如圖1(b)所示，通氣脅迫萌發(fā)初期，糙米胚芽緩慢生長。發(fā)芽30 h

圖1 通氣處理對發(fā)芽糙米GABA含量、芽長和發(fā)芽率的影響

后，芽體生長速率加快，芽長可達到0.5 cm左右，此時未通氣的糙米芽長約為0.2 cm，通氣處理對芽長的影響在糙米外觀圖(圖2)中表現(xiàn)的更為直觀。根據(jù)DB 32/T 2309—2013《發(fā)芽糙米通用規(guī)范》，發(fā)芽糙米的芽長應在0.2 cm以內(nèi)，顯然全程通氣工藝并不適用。

結(jié)合全程通氣對GABA含量和芽長的影響，考慮縮短通氣時間并采用發(fā)芽后期通氣的方式，即從發(fā)芽21 h后開始通氣，通氣時間為9 h，共發(fā)芽30 h。由圖1(c)可知，通氣9 h發(fā)芽的糙米中GABA含量高于不通氣的對照樣。通氣量低于1.5 L/min時，GABA含量隨通氣量增大而升高，但高于1.5 L/min后略微下降。這與王玉萍等[26]的結(jié)果一致，但最佳通氣量稍有不同，可能是糙米原料存在差異。同時，采用發(fā)芽后期通氣處理9 h的工藝能有效控制發(fā)芽糙米的芽長，其中通氣量為1.5 L/min的芽長約為0.2 cm，符合標準。此外，通氣處理還略微提升了糙米的發(fā)芽率，如圖1(d)所示，未通氣處理的糙米發(fā)芽率為88.10%，而經(jīng)9 h通氣處理的糙米發(fā)芽率均可達到90%。因此，確定通氣條件為浸泡發(fā)芽21 h后以1.5 L/min 的速率進行通氣處理9 h，共發(fā)芽30 h。

圖2 全程通氣條件下發(fā)芽糙米的外觀圖

2.2 金屬離子脅迫萌發(fā)

分別選擇硫酸鋅、氯化鎂、氯化鈣、硫酸銅和硫酸鋁5種金屬鹽作為浸泡液探究金屬離子對發(fā)芽效果的影響，對照樣為去離子水發(fā)芽36 h的糙米。如圖3(a)所示，氯化鈣和硫酸鋁處理能顯著提高發(fā)芽糙米中GABA含量，而且高濃度比低濃度更能促進糙米產(chǎn)生GABA。GAD催化谷氨酸脫羧生成GABA，而調(diào)控該過程的GAD被激活的前提是GAD結(jié)合位點與鈣離子和鈣調(diào)蛋白的復合物相結(jié)合，因此，Ca2+的添加能促進激活GAD[16]，從而促進GABA的生成。Al3+對GABA富集效果的研究還未見報道，李曉丹等[20]發(fā)現(xiàn)Al3+能夠脅迫苦蕎起到富集黃酮的效果，具體的機理目前仍不清楚，還有待進一步的研究。經(jīng)測定，氯化鈣、硫酸鋁脅迫發(fā)芽30 h的糙米中鈣和鋁的殘留量分別為208，334 mg/kg[圖3(b)]，鋁殘留量高于GB 2762—2005《食品中污染物限量標準》中規(guī)定的上限(100 mg/kg)。因此，Ca2+更適合用于糙米的脅迫萌發(fā)。

圖3 金屬離子脅迫萌發(fā)對發(fā)芽糙米中GABA含量的影響

如圖3(c)所示，糙米在濃度梯度為0.1～100.0 mmol/L 的氯化鈣中浸泡發(fā)芽，GABA含量呈階梯式上升趨勢。這與韓永斌等[27]的報道稍有不同，并非嚴格意義上的低濃度促進、高濃度抑制。在氯化鈣濃度為40 mmol/L時，GABA含量呈現(xiàn)最高值，因此選擇30～50 mmol/L 梯度進一步試驗。由圖3(d)可知，氯化鈣濃度為35 mmol/L時，GABA含量最高為24.71 mg/100 g，繼續(xù)提高Ca2+濃度，GABA含量呈下降趨勢。因此，在隨后的雙重脅迫萌發(fā)的研究中，金屬離子選用Ca2+，考察濃度為25～45 mmol/L。

2.3 糙米雙重脅迫萌發(fā)

2.3.1 Ca2+濃度對糙米雙重脅迫萌發(fā)效果的影響 由圖4(a)可知，在1.5 L/min通氣的條件下，GABA含量隨著氯化鈣濃度的增加呈先上升后降低的趨勢，當氯化鈣濃度為35 mmol/L時，達到最高值26.47 mg/100 g。這可能是24 h前只有氯化鈣脅迫，此階段氯化鈣對GABA的作用與單一脅迫階段相同，24 h后加入通氣處理，糙米有氧呼吸速率提高，GABA生成量比單一脅迫階段高。GABA的生成與消耗是一個動態(tài)平衡的過程[28]，即GAD將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA的同時，GABA作為GABA轉(zhuǎn)氨酶的底物也在源源不斷地被消耗。當GABA累積到一定程度，在GABA轉(zhuǎn)氨酶的作用下，GABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛的速度也相應增加，從而導致GABA含量呈下降趨勢。不同氯化鈣濃度條件下，雙重脅迫萌發(fā)后糙米的發(fā)芽率和芽長分別見圖4(b)、(c)。雙重脅迫萌發(fā)的糙米，發(fā)芽率顯著高于對照組，但是不同Ca2+濃度條件下糙米發(fā)芽率的區(qū)別不明顯。發(fā)芽糙米的芽長均在0.2 cm以內(nèi)，不同Ca2+濃度條件下糙米芽長區(qū)別不大。因此，最佳的氯化鈣溶液濃度是35 mmol/L。

圖4 Ca2+濃度對糙米雙重脅迫萌發(fā)效果的影響

2.3.2 通氣量對糙米雙重脅迫萌發(fā)效果的影響 由圖5(a)可知，在35 mmol/L的氯化鈣溶液浸泡下，隨著通氣量的增加，糙米中GABA含量呈先緩慢增長后下降的趨勢。相比于單一的9 h通氣處理，35 mmol/L的氯化鈣脅迫能大幅度提高GABA產(chǎn)率，因此不同通氣量條件下，GABA的變化較小。由圖5(b)、(c)可知，通氣處理的糙米發(fā)芽率顯著高于不通氣處理的，雙重脅迫的糙米發(fā)芽率(92%以上)也高于發(fā)芽36 h的對照組(89.89%)?？梢?，通氣處理對糙米的發(fā)芽率略有提升的作用。此外，雙重脅迫處理的糙米芽長均在0.2 cm左右。因此，以GABA含量為主要參考指標，確定了糙米雙重脅迫萌發(fā)的工藝為：在35 mmol/L的氯化鈣溶液中浸泡發(fā)芽21 h后以1.5 L/min的通氣量通氣9 h，共發(fā)芽30 h。

圖5 通氣量對糙米雙重脅迫萌發(fā)效果的影響

2.4 糙米雙重脅迫萌發(fā)效果驗證

采用所確定的雙重脅迫萌發(fā)工藝，對其他8種糯米、粳米和秈米分別進行發(fā)芽試驗。結(jié)果表明，經(jīng)過雙重脅迫發(fā)芽的糙米中GABA含量顯著高于對照樣的(圖6)，且GABA的增長率均>50%，表明雙重脅迫萌發(fā)工藝對各品種的糙米具有普遍適用性。其中，中浙優(yōu)1和湘晚秈13這兩種糙米的GABA的增長率分別達到了134.40% 和116.52%，提升效果突出。

圖6 雙重脅迫萌發(fā)處理對不同品種糙米GABA 含量的影響

Figure 6 Content of GABA in brown rice of different varieties under multiple stress germination was compared with that of the control group

3 結(jié)論

經(jīng)過對發(fā)芽糙米進行雙重脅迫萌發(fā)的探究，確定最佳萌發(fā)工藝條件為：35 mmol/L的氯化鈣溶液為浸泡液，發(fā)芽至21 h時以1.5 L/min的通氣量通氣處理，共發(fā)芽30 h，此工藝下制備的發(fā)芽糙米GABA含量為28.15 mg/100 g，經(jīng)驗證，雙重脅迫萌發(fā)的糙米GABA含量均比未脅迫的提高50%。同時，在通氣和Ca2+的脅迫處理下，發(fā)芽周期比普通發(fā)芽糙米短，發(fā)芽率也比普通發(fā)芽糙米高，并且該工藝適用于多種糙米品種。利用通氣脅迫能有效減緩微生物的滋生與無氧發(fā)酵，但是本研究采用的浸泡式發(fā)芽方法會產(chǎn)生大量的廢水，廢水的處理與利用仍有待進一步的研究，由于廢水中可能存在大量的GABA，廢棄浸泡液中GABA的提取與純化也是研究的一個方向。