伍 娟，劉 赟，趙錦燕，樓 瑩，李 煌，洪振豐△

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心，福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122)

肝損傷是由于手術(shù)打擊、創(chuàng)傷、微生物感染、肝臟疾病、有毒化合物、藥物毒副作用、免疫紊亂、遺傳變異、代謝失常、理化刺激等導(dǎo)致的肝細(xì)胞、肝組織甚至整個(gè)肝臟器官的形態(tài)與功能的病理改變[1]。肝損傷是慢性肝病重要的病理性特征，是嚴(yán)重危害人類健康的世界性問題，是治療慢性肝臟疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)外尚無理想的抗肝損傷藥物，因此尋找有效藥物阻斷、延緩及逆轉(zhuǎn)肝損傷的發(fā)生發(fā)展在肝病的治療中有重要意義。理想的抗肝損傷藥物應(yīng)具有良好的耐受性，對肝臟有特異的靶效應(yīng)，無毒或者低毒，天然藥物及中草藥在這方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。復(fù)方片仔癀肝寶主要成分為茵陳、龍膽、梔子、蛇膽、牛黃、白芍、三七、麝香、甘草等，是漳州片仔癀藥業(yè)有限公司在香港上市的保肝產(chǎn)品，具有清肝利膽、利濕退黃、活血祛瘀等功效。課題組前期研究表明，片仔癀肝寶具有防治肝損傷的作用[2-6]。本文旨在探討片仔癀肝寶靶向調(diào)控miR-155及其下游靶基因IL-6、IL-10的表達(dá)，研究其對肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為片仔癀肝寶臨床用于防治肝損傷奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(許可證號SCXK，滬2017-0005，批號2015000544478)。

1.2 主要藥品與試劑

復(fù)方片仔癀肝寶(GB)由片仔癀藥業(yè)有限公司提供(批號1405005)；西利賓胺(江蘇中興藥業(yè)有限公司，批號國藥準(zhǔn)字H32026145)。AST試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號20171229)；ALT試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號20180104)；IL-6、IL-10大鼠酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司 (批號20170826)；四氯化碳，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號20130514)；SYBR Green q PCR Super Mix(ABI-invitrogen公司)；目的基因引物DNA(北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器設(shè)備

qPCR儀(7500/7500 Fast Real-Time PCR System，美國ABI公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(64R，美國Beckman Allegra公司)；APC 300 電泳儀(美國BioRad 公司)；酶標(biāo)儀(ELX808，德國寶特公司)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物造模、分組及給藥 雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±10)g,按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、陽性藥物對照組(西利賓胺20 mg/kg)、復(fù)方片仔癀肝寶高劑量組(600 mg/kg)、復(fù)方片仔癀肝寶中劑量組(300 mg/kg)、復(fù)方片仔癀肝寶低劑量組(150 mg/kg)每組各10只。各實(shí)驗(yàn)組按照不同劑量灌胃給藥0.5 ml/100 g,連續(xù)7 d,每日1次。除空白對照組外其他5組大鼠末次給藥1 h后，按2 ml/kg給予50%CCL4花生油溶液腹腔注射造模，空白組腹腔注射2 ml/kg花生油。

1.4.2 取材 腹腔注射CCL4，24 h后稱重，用3%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈采血處死，取肝臟稱重。分離血清，-20 ℃保存，用于測定血液生物化學(xué)指標(biāo)；迅速分離整個(gè)肝臟，稱重，然后取右葉肝組織1×1×1 cm3，用4%多聚甲醛固定，用于形態(tài)學(xué)檢測。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 血清 ALT、AST測定 比色法檢測大鼠血清中ALT、AST的活性，麻醉后腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h后用離心機(jī)離心10 min(3000 r/min)取上清，按試劑盒說明書檢測ALT、AST。

1.5.2 ELISA檢測血清中IL-6、IL-10含量 大鼠血清以PBS進(jìn)行5倍稀釋，鋁箔袋在室溫平衡20 min后取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。樣本孔先加入10 μL待測樣本，再加入40 μL樣本稀釋液，空白孔不加。向標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔各加入100 μL抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，恒溫箱溫育60 min，空白孔不加。棄去液體，吸水紙拍干后向每孔加滿洗滌液，靜置1 min后，甩去洗滌液后再吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次。每孔各加入50 μL底物A、B，37 ℃避光孵育15 min。每孔各加入50 μL終止液，于15 min內(nèi)在相應(yīng)波長處測定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.5.3 肝組織病理學(xué)觀察 取肝右中央葉多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

1.5.4 Q-PCR法檢測大鼠肝組織中miR-155和IL-6、IL-10表達(dá)水平 提取RNA：TRIZOL法提取總RNA，肝組織總RNA純度及含量測定。Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)miR-155及下游靶基因IL-6、IL-10的引物(引物序列詳見表1),用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-155實(shí)時(shí)定量PCR以U6為內(nèi)參照(U6為一類核小分子RNA，由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)，定位于細(xì)胞核內(nèi)，表達(dá)穩(wěn)定，在檢測基因表達(dá)水平變化時(shí)常用它做參照物，為通用的內(nèi)參基因)，SYBRGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系(20 μL)，具體步驟參見試劑盒說明書。以目的基因相對表達(dá)量作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算miR-155和IL-6、IL-10的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方片仔癀肝寶對血清中AST、ALT影響

表2顯示，模型組大鼠血清ALT和AST顯著高于正常組(P<0.01)；GB低劑量組、GB中劑量組、GB高劑量組、西利賓胺組大鼠血清ALT和AST水平顯著低于模型組(P<0.01)。結(jié)果表明，西利賓胺、片仔癀肝寶均有降低大鼠轉(zhuǎn)氨酶的作用。

2.2 復(fù)方片仔癀肝寶對血清中IL-6、IL-10的影響

表2顯示，與正常組比較，模型組IL-6的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，IL-10的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方片仔癀肝寶各劑量組和西利賓胺組IL-6的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，IL-10的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，復(fù)方片仔癀肝寶對IL-6、IL-10表達(dá)有顯著的調(diào)控作用。

表2 復(fù)方片仔癀肝寶對血清AST、ALT、IL-6、IL-10的影響

注：與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

注：A．正常組：肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝細(xì)胞為多邊形,細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核明顯,未見肝細(xì)胞變性、炎性浸潤及肝臟組織壞死；B.模型組：肝組織損傷嚴(yán)重，大部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞廣泛水腫，黑箭頭所示處肝細(xì)胞胞質(zhì)腫脹明顯，呈氣球樣變及空泡變性，且伴有炎癥細(xì)胞浸潤;C．西利賓胺組：肝小葉結(jié)構(gòu)正常，明顯改善肝細(xì)胞氣球樣變及空泡變性；D.GB低劑量組：細(xì)胞呈放射狀排列,散在少量氣球樣變及空泡；E.GB中劑量組：細(xì)胞呈放射狀排列，細(xì)胞核位置、形態(tài)正常，細(xì)胞腫脹減輕；F.GB高劑量組：肝索排列整齊，明顯改善肝細(xì)胞氣球樣變和空泡變性圖1 復(fù)方片仔癀肝寶對病理組織學(xué)的影響(HE染色 20×)

2.3 復(fù)方片仔癀肝寶對病理組織學(xué)的影響

圖1顯示，復(fù)方片仔癀肝寶對病理組織學(xué)的影響。

2.4 復(fù)方片仔癀肝寶對肝組織中IL-6、IL-10、miR-155mRNA表達(dá)的影響

表3顯示，與正常組比較，模型組IL-6、miR-155的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，IL-10的表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組比較，復(fù)方片仔簧肝寶各劑量組和西利賓胺組IL-6、miR-155的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，IL-10的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，結(jié)果表明復(fù)方片仔癀肝寶對miR-155、IL-6、IL-10表達(dá)有顯著調(diào)控作用。

表3 復(fù)方片仔癀肝寶對肝組織中IL-6、IL-10、miR-155mRNA表達(dá)的影響

注：與正常組比較：1)P<0.01，2)P<0.05，3)與模型組比較：P<0.01

3 討論

肝損傷的主要原因包括暴力性肝損傷、病理性肝損傷、化學(xué)性肝損傷等。大多數(shù)肝損傷的病理進(jìn)程都伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，通常認(rèn)為炎癥反應(yīng)是引起肝損傷和肝病慢性化至關(guān)重要的因素。在炎癥發(fā)生過程中，肝臟的固有免疫細(xì)胞被激活，釋放出大量的促炎因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6等，炎癥因子之間互相促進(jìn)產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，進(jìn)一步加重肝損傷。大多數(shù)肝損傷的過程中，都存在IL-6升高、IL-10降低[7-9]，這說明炎癥因子和肝損傷密切相關(guān)，通過調(diào)控炎癥因子可以達(dá)到控制和治療肝損傷的目的。四氯化碳(CCl4)是經(jīng)典、廣泛應(yīng)用的急性肝損傷模型，該模型在實(shí)驗(yàn)早期即可見明顯的肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。CCl4進(jìn)入機(jī)體后，使得ALT、AST、炎癥介質(zhì)等異常增高，其中ALT和AST是診斷肝膽系統(tǒng)疾病中應(yīng)用最廣泛的酶，是判斷肝細(xì)胞受損害程度的敏感指標(biāo)[10]。

MicroRNAs(miRNAs)是指一大類廣泛存在于真核生物中約19～22個(gè)核苷酸所組成的小分子非編碼RNA。其作用通過與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合抑制或降解其表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-155基因是一個(gè)典型的多功能基因，被認(rèn)為是新興的炎癥遞質(zhì)，已被報(bào)道參與多種生理與病理過程，如炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等，在調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫及維持系統(tǒng)穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，多種肝臟疾病及肝損傷過程中都存在miR-155的升高[11-13]，miR-155可作為肝臟損傷的生物標(biāo)記物，并且miR-155能抑制巨噬細(xì)胞向M2型分化，而使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[14-15]；miR-155能促進(jìn)IL-6表達(dá)的同時(shí)，通過正反饋機(jī)制促進(jìn)自身表達(dá)來發(fā)揮促炎作用[16]；miR-155表達(dá)的急性下調(diào)可減弱炎癥反應(yīng)和纖維化反應(yīng)，miR-155拮抗劑可引起抗炎因子IL-10表達(dá)增加[17]，因此miR-155與肝損傷密切相關(guān)。

課題組前期研究表明，復(fù)方片仔癀肝寶能減輕肝臟細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤等病理組織學(xué)病變，對肝組織脂肪變性、肝內(nèi)脂類聚集也有明顯的改善作用；降低血清TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子的含量及活性達(dá)到保護(hù)急性、慢性肝損傷的作用[3-6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方片仔癀肝寶通過降低miR-155的表達(dá)，激活免疫系統(tǒng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，降低炎癥級聯(lián)反應(yīng)和IL-6表達(dá)，防止中性粒細(xì)胞向肝細(xì)胞浸潤，減輕肝臟損傷。IL-10是一種強(qiáng)效的抗炎性細(xì)胞因子，國內(nèi)外學(xué)者已證實(shí)IL-10在肝損傷過程中發(fā)揮著重要保護(hù)作用，是一個(gè)極其關(guān)鍵的肝臟保護(hù)性細(xì)胞因子[18-19]。復(fù)方片仔癀肝寶通過升高IL-10的表達(dá)，減少肝組織局部中性粒細(xì)胞的浸潤、活化，降低中性粒細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，以減輕肝細(xì)胞的損傷；同時(shí)還可以降低局部炎性細(xì)胞因子的活性，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，加強(qiáng)對肝細(xì)胞的保護(hù)。

綜上所述，復(fù)方片仔癀肝寶能通過調(diào)控miR-155及IL-6和IL-10表達(dá)，減輕肝損傷的炎癥反應(yīng)，是其防治肝損傷的機(jī)制之一。