李 波，宋順鵬，吳美蘭

(1.大連市皮膚病醫(yī)院中醫(yī)皮膚科，遼寧 大連 116021；2.大連市中醫(yī)醫(yī)院 中醫(yī)婦科，遼寧 大連 116013)

雷公藤是對風(fēng)濕免疫疾病及腎病治療有獨特療效的藥物，但又對心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等有明確的損害，限制了臨床應(yīng)用。中醫(yī)治療疾病是采用不同性味、功效的中藥配伍組成復(fù)方來遣藥組方。一些“有毒中藥”(如雷公藤、附子等)在治療疑難病癥方面有獨特療效，但因其對機體的毒副作用而臨床使用受到限制。綜合中醫(yī)七情相殺、調(diào)和藥性、扶助正氣配伍諸法，來減弱中藥毒性是臨床常用方法。中藥配伍理論成為其主要的減毒依據(jù)，可使雷公藤減毒增效從而應(yīng)用于臨床[1]。雷公藤治療很多難治性疾病療效顯著，但其副作用明顯。本研究綜合中醫(yī)配伍諸法，傳統(tǒng)的中醫(yī)理論與現(xiàn)代疾病發(fā)病機制結(jié)合組成復(fù)方雷公藤湯，拆方實驗干預(yù)腎病綜合征，探討配伍減毒增效的可行性，篩選最佳藥物組合[2]。增效方面以腎病大鼠24 h尿蛋白、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、膽固醇(chol)為指標(biāo)，對心臟減毒以肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)為考察指標(biāo)，并考察不同配伍對腎臟、心臟組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取普通級Wister大鼠110只(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)，7～8周齡，體質(zhì)量(200±10)g，均為未曾交配雌性(動物合格證號SCXK(遼)2004-0016)。按完全隨機化原則分為11組，其中腎病模型組9組(雷公藤組、雷芪組、雷歸組、雷何組、全方組、雷金組、雷甘組、強地松組、模型空白組)，空白組2組(正?？瞻捉M、正常公藤組)，每組10只，分籠飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

中藥雷公藤(福建)為衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.的全株，甘草(內(nèi)蒙)為豆科多年生草本植物Glycyrrhiza glabra L.的根及莖，黃芪(內(nèi)蒙古)為豆科多年生草本植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Beg.Var.的根，何首烏(四川)為蓼科多年生纏繞草本植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的塊根，當(dāng)歸(甘肅)為傘形科多年生草本植物當(dāng)歸Angelica sinensis Diels的根，金錢草(浙江)為報春花科多年生草本植物過路黃Lysimachia christinae Hance的全草，購于沈陽天益堂藥房。醋酸潑尼松5 mg/片，100片裝/瓶(天津太平洋制藥有限公司，批號060401)；注射用鹽酸阿霉素10 mg/只，5只裝(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號060504)；生理鹽水500 ml/瓶(錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號0609022)；20%烏拉坦，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理基地提供；75%酒精500 ml/瓶(沈陽市富康消毒藥劑廠，批號20070518)；甲醛固定液由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒室提供；戊二醛固定液由中國醫(yī)科大學(xué)第二電鏡室提供。

1.3 主要儀器

全自動生化儀(BECKMAN-CX3美國)；光鏡Olympus,Japan；電鏡JEM-1200EX；LKB-I型超薄切片機；ES-J系列電子分析天平(沈陽龍騰電子稱量儀器公司)；Sigma冷凍離心機。

1.4 模型制備與給藥

參照Fermandez-Llama等[3]方法，造成其形態(tài)學(xué)改變和臨床表現(xiàn)與人的微小病變相似腎病模型，采用一次性尾靜脈注射阿霉素復(fù)制。模型組：非麻醉下按6.5 mg/kg體質(zhì)量一次性尾靜脈注射阿霉素(2%阿霉素0.65 ml)。模型評估：造模3 d后大鼠逐漸出現(xiàn)食欲減退、行動遲緩、皮毛無光澤、廝咬、煩躁、腹水。造模第7天后用代謝籠收集24 h尿液測尿蛋白定量，呈漸進性增多，與文獻報道一致則造模成功?？瞻捉M：同法注射0.65 ml生理鹽水。復(fù)方雷公藤湯(全方)及拆方：6味中藥按體表面積換算法，D鼠=D人×R鼠/R人，確定各味藥物的劑量。全方、拆方各藥劑量均相同：雷公藤60 g，甘草19.6 g，當(dāng)歸19.6 g，何首烏39.2 g，黃芪49 g，金錢草68.6 g。其中雷公藤方雷公藤60 g，雷何方中雷公藤60 g，何首烏39.2 g，雷歸方中雷公藤60 g，當(dāng)歸19.6 g，雷芪方中雷公藤60 g，黃芪49 g。全方中雷公藤60 g，何首烏39.2 g，黃芪49 g，當(dāng)歸19.6 g，甘草19.6 g，金錢草68.6 g；雷金方中雷公藤60 g，金錢草68.6 g；雷甘方中雷公藤60 g，甘草19.6 g。各方入水量2000 ml，雷公藤先煎1 h后下諸藥，常規(guī)煎煮2次，去藥渣后合并藥液濃縮成300 ml。各方含生藥量：雷公藤方0.2 g/ml，雷何方0.33 g/ml，雷歸方0.264 g/ml，雷芪方0.363 g/ml，全方0.853 g/ml，雷金方0.428 g/ml，雷甘方0.264 g/ml。各組從造模第15天起開始經(jīng)口灌藥2 ml，每日1次，共給藥2周。強地松組5 mg/kg灌胃2周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 生化檢測 打開腹腔剝離臟器，暴露腹主動脈，用10 ml注射器抽取6 ml動脈血，離心3500 r/10 min，取血清2 ml送生化室用BECKMAN-CX3全自動生化儀檢測血脂、血漿蛋白、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶指標(biāo)。

1.5.2 組織形態(tài)學(xué)光鏡 打開胸腹腔后取左腎、心臟，標(biāo)本用10%甲醛固定，組織塊修整、洗滌、脫水、透明、包埋、HE染色、封固，顯微鏡下觀察。

1.5.3 超微結(jié)構(gòu)電鏡 打開胸腹腔后用鋒利的解剖刀剪取左腎、心臟一小塊組織，放在預(yù)冷的3%戊二醛固定液中，鋒利刀片切成1 mm3小塊。緩沖液清洗，1%鋨酸后固定、緩沖液清洗、酒精梯度脫水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠干預(yù)前后對尿蛋白的影響

表1顯示，模型組治療前、1周、2周后24 h尿蛋白較正常組均升高(P<0.01)，正常公藤組治療1周、2周后24 h尿蛋白較正常組升高(P<0.01)，各治療組治療1周后24 h尿蛋白較模型空白組降低(P<0.05)，2周后較模型空白組降低(P<0.01)，治療組中全方組、雷芪組、強地松組、雷甘組治療1周后24 h尿蛋白較治療前均降低(P<0.05)，2周后較治療前均降低(P<0.01)，治療組中雷金組、雷何組、雷歸組治療2周后24 h尿蛋白較治療前均降低(P<0.05)，起治療作用。治療組中全方組、雷芪組、雷甘組治療2周后24 h尿蛋白較模型公藤組均降低(P<0.05)，起增效作用。

2.2 各組大鼠干預(yù)后對血漿蛋白、血脂、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的影響

模型組中空白組較正常空白組TP降低(P<0.05)，ALB降低(P<0.01)，CHO、TG、CK、CK-MB升高(P<0.01)，說明阿霉素對心臟有毒性作用。模型公藤組較正?？瞻捉MTP、ALB降低(P<0.05)，CHO、TG、CK、CK-MB升高(P<0.01)，治療組中全方組、雷芪組、雷甘組TP、ALB較模型公藤組升高(P<0.05)，chol、TG較模型公藤組降低(P<0.01)，治療組中雷金組、雷何組、雷歸組chol、TG較模型公藤組降低(P<0.05)，治療組中全方組、雷何組、雷芪組、雷甘組CK、CK-MB較模型公藤組降低(P<0.01)，治療組中雷歸組、雷金組CK、CK-MB較模型公藤組降低(P<0.05)起到增效作用。治療組中全方組、雷何組、雷芪組、雷甘組CK、CK-MB較雷歸組、雷金組降低(P<0.05)，治療組中全方組、雷何組、雷芪組和雷甘組對抗雷公藤心臟毒性較雷歸組和雷金組好。模型公藤組CK、CK-MB較模型空白組升高(P<0.01)，正常公藤組CK、CK-MB較正?？瞻捉M升高(P<0.01)，雷公藤在病理生理狀態(tài)下對心臟有毒性作用。

表1 各組大鼠干預(yù)前后尿蛋白變化情況比較

注:與模型空白組比較：aP<0.05，bP<0.01；各組自身前后比較：cP<0.05，dP<0.01；與模型公藤組比較：eP<0.05；與正常組組比較：fP<0.01

表2 各組大鼠干預(yù)后血漿蛋白、血脂、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶比較

注:與模型空白組比較：aP<0.05，bP<0.01；與正?？瞻捉M比較：cP<0.05；dP<0.01；與模型公藤組比較：eP<0.05，fP<0.01；與雷金組比較：gP<0.05

2.3 腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

圖1、2顯示，HE 染色光鏡觀察，模型公藤組:腎小球基質(zhì)稍增多，腎小管空泡變性，遠端腎小管擴大，腎間質(zhì)中度彌漫性水腫,輕度灶性纖維化和炎細胞浸潤；雷何組:腎小球毛細血管壁變薄，遠端腎小管擴大，上皮細胞增大，腎小球基質(zhì)稍增多不明顯；各配伍組：腎小球毛細血管壁變薄減輕，基底膜輕微增厚，上皮細胞增大不明顯，系膜細胞輕度增生；透射電鏡觀察，模型公藤組：腎小球束壁黏連，足細胞部分溶合。足細胞表面微絨毛化，其胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡變性，腎小球足細胞廣泛融合，其胞質(zhì)內(nèi)線粒體較多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，足細胞表面微絨毛化，毛細血管腔內(nèi)見有紅細胞；各配伍組：腎小球束壁、毛細血管腔、足細胞病理改變均有減輕[4]。

注：A.模型公藤組；B.雷何組；C.雷歸組；D.雷芪組；E.全方組；F.雷金組；G.雷甘組；H.強地松組；I.模型空白組；J.正?？瞻捉M；K.正常公藤組圖1 光學(xué)顯微鏡下各組大鼠腎組織比較(蘇木精和伊紅染色 ×200)

注：A.模型公藤組；B.雷何組；C.雷歸組；D.雷芪組；E.全方組；F.雷金組；G.雷甘組；H.強地松組；I.模型空白組；J.正?？瞻捉M；K.正常公藤組圖2 電子顯微鏡下各組大鼠腎組織形態(tài)變化比較(×6000)

注：A.模型公藤組；B.雷何組；C.雷歸組；D.雷芪組；E.全方組；F.雷金組；G.雷甘組；H.強地松組；I.模型空白組；J.正?？瞻捉M；K.正常公藤組圖3 光學(xué)顯微鏡下各組大鼠心組織比較(蘇木精和伊紅染色 ×200)

注：A.模型公藤組；B.雷何組；C.雷歸組；D.雷芪組；E.全方組；F.雷金組；G.雷甘組；H.強地松組；I.模型空白組；J.正?？瞻捉M；K.正常公藤組.圖4 電子顯微鏡下各組大鼠心組織形態(tài)變化比較(×6000)

2.4 心臟組織形態(tài)學(xué)改變

圖3、4顯示，HE 染色光鏡觀察，模型公藤組:心肌細胞排列紊亂，肌間隙變寬，部分心肌肌原斷裂，部分肌源纖維溶解；各配伍組：心肌細胞排列整齊，心肌間隙無明顯增寬；透射電鏡觀察，模型公藤組:肌纖維局部溶解、斷裂，并伴有肌纖維水腫，肌間線粒體量較多，其嵴有溶解多呈水腫空泡樣變性，有的線粒體外膜破壞，肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，肌纖維多處溶解、斷裂；各配伍組：肌纖維、肌間線粒體病理改變較模型公藤組明顯減輕。

3 討論

近年來，以“馬兜鈴酸腎毒性”和“魚腥草注射液不良反應(yīng)”為代表的中藥毒性事件，引起社會的巨大反響和廣泛關(guān)注，使得中藥在治療各項疾病時的安全性備受關(guān)注[5]。歷代醫(yī)家采用配伍、炮制、調(diào)節(jié)用量、煎煮、服法等方法對有毒中藥實施減毒增效，而其中配伍減毒法又派生相殺、調(diào)和、解毒、佐制、扶正等減毒法[6]。復(fù)方雷公藤湯據(jù)諸法組合而成，方含雷公藤20 g，生甘草10 g，炙黃芪25 g，金錢草35 g，酒當(dāng)歸10 g，制何首烏20 g，功用益氣養(yǎng)血、解毒化濁、利水消腫。以雷公藤活血解毒、消腫除濕為君藥；黃芪、當(dāng)歸和何首烏三藥補氣血扶正、益精血，以防雷公藤戕伐之害共為臣藥；金錢草利水消腫、清熱解毒，助君藥之力兼殺其毒為佐藥；甘草補中益氣以扶正、解藥毒緩君藥之性，另可調(diào)和諸藥，故為使藥。甘草是最常用的中草藥之一，具有清熱解毒、保肝抗炎和調(diào)和諸藥等功效，黃芪與雷公藤配伍可顯著減輕雷公藤所致心損傷[7]。前期已做復(fù)方雷公藤湯及拆方對腎病大鼠血液系統(tǒng)的減毒增效作用研究。實驗結(jié)果表明，雷公藤配伍后可起到減低雷公藤對血液系統(tǒng)毒性的作用[8]。

實驗結(jié)果表明，在減少24 h尿蛋白、提高血漿蛋白、降血脂方面，雷芪組和雷甘組效果較其他配伍組為優(yōu)，考慮是黃芪和甘草具有免疫調(diào)節(jié)和類似皮質(zhì)激素樣作用。正常公藤組2周后出現(xiàn)尿蛋白，較正?？瞻捉M有統(tǒng)計學(xué)意義，表明長期服用雷公藤對腎臟確有毒性[9]。在保護心肌、降低CK、CK-MB方面，雷何組、雷芪組、雷甘組較雷歸組、雷金組效果好?，F(xiàn)代藥理實驗證實，黃芪對缺氧缺糖條件下培養(yǎng)心肌細胞具有明顯的保護作用，可加強心肌細胞的代謝及補償能力。

國內(nèi)雷公藤減毒增效研究表明，雷公藤各部位的采摘季節(jié)以秋季為佳，臨床藥用部位主要為根及根莖[10]。孫龍等[11]確定了三七、地黃在清絡(luò)通痹精簡方中起到降低雷公藤毒性的作用。秦思等[12]研究結(jié)果表明，雷公藤多苷配伍黃芪總皂苷使用可顯著減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，是通過降低血清中炎癥因子水平達到的，并具有減毒增效的作用。周玲玲等[13]將雷公藤分別與生地黃、青風(fēng)藤、僵蠶、三七配伍。雷公藤復(fù)方配伍不同功效藥物影響雷公藤的體內(nèi)代謝過程和體內(nèi)物質(zhì)的代謝過程，達到配伍減毒的目的，是可調(diào)節(jié)肝細胞色素P450酶的含量，差異調(diào)控肝細胞色素P450酶不同亞型的表達取得的。唐利宇等[14]]考察黃芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量變化，證實黃芪與雷公藤配伍可降低其毒性，并結(jié)合中藥七情中“相畏相殺”理論，采用高效液相色譜法比較分析黃芪配伍雷公藤前后毒性成分雷公藤內(nèi)酯酮含量變化，從化學(xué)成分層次分析其減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)變化。

總之，雷公藤是一種獨特療效的中藥，兼具很好的治療作用和巨大的毒副作用。如何揚長避短，使雷公藤的療效大幅度提高，同時又降低其毒性是今后對雷公藤進行深入研究的方向[15]。由文獻可知，傳統(tǒng)的炮制、配伍減毒、劑型改革和結(jié)構(gòu)修飾，再到高分子技術(shù)與生物技術(shù)的應(yīng)用，均旨在最大限度地減少雷公藤自身在治療疾病過程中產(chǎn)生的毒副作用，并增強其療效[16]。復(fù)方雷公藤湯及拆方對腎病大鼠確有減毒增效的作用，其降低腎病尿蛋白、血脂，升高血漿白蛋白，起到增效作用；在對抗雷公藤心臟毒性方面都篩選出最佳配伍。具體說來，治療腎病增效方面,全方、雷芪組、雷甘組為佳，減低心臟毒性則以全方、雷芪組、雷何組、雷甘組為佳，全方組為毒效最優(yōu)化復(fù)方，為本方臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供了前期研究基礎(chǔ)。目前中藥減毒實踐中應(yīng)用最為有效和廣泛的方法仍然是炮制、配伍減毒法，具有廣泛的應(yīng)用性。對中藥減毒方法的研究，要想取得突破性進展，應(yīng)該在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，引入多學(xué)科、多途徑、多手段，結(jié)合體外和體內(nèi)實驗，為臨床合理用藥提供理論和實踐依據(jù)[17]。要在中醫(yī)藥辨證論治和整體觀念的指導(dǎo)下，通過中藥配伍發(fā)揮減毒作用，展示其“多靶點”整體作用的治療優(yōu)勢。中藥配伍減毒的研究需將傳統(tǒng)的中醫(yī)理論與保護雷公藤毒性靶標(biāo)的藥物結(jié)合，深入開展雷公藤配伍減毒機制研究，篩選出雷公藤毒效關(guān)系最優(yōu)化的中藥小復(fù)方，提高腎病、皮膚病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等難治疾病的治療效果[18]。