閆麗紅 楊利軍 楊 濤*

（1 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原030001；2 山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，山西 太原030001）

結(jié)直腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，近年來在我國(guó)大城市發(fā)病率和病死率逐年攀升。在結(jié)腸癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，5年存活率只有10%[1]，其在常發(fā)腫瘤中排名第3。因此，對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展與發(fā)病機(jī)制的深入研究具有重要意義。剪接因子SRSF7（也稱9G8）是一個(gè)可以穿梭于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的SR蛋白家族成員[2]，有研究報(bào)道核質(zhì)穿梭的SRSF7蛋白可通過與介導(dǎo)mRNA出核的NXF1/TAP（mRNA核蛋白輸出因子/異常糖鏈糖蛋白）蛋白相互作用，從而調(diào)控mRNA出核[3]，調(diào)節(jié)SRSF7蛋白的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究報(bào)道SRSF7的敲低可以抑制HCT116增殖而促進(jìn)凋亡[4]。目前有關(guān)SRSF7在動(dòng)物水平的研究尚不明確，因此，本研究將進(jìn)一步在動(dòng)物水平探究SRSF7在結(jié)直腸癌生長(zhǎng)過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料：本實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞株HCT116由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。BABL/c雄性裸鼠，鼠齡4~5周，體質(zhì)量18~20 g，共計(jì)10只，購(gòu)自北京維通利華有限公司，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為SPF級(jí)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)用McCoy's 5A培養(yǎng)基購(gòu)自Sangon公司，胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液和青鏈霉素混合物購(gòu)自Solarbio公司。Ki-67單克隆抗體和cleaved Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物PV-6000購(gòu)自中杉金橋生物公司，PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自TaKaRa公司，SRSF7 shRNA病毒由吉?jiǎng)P基因公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.21 慢病毒載體的構(gòu)建：設(shè)計(jì)srsf7 shRNA干擾靶點(diǎn)序列（5'-AGGAG AGUUAGAAAGGGCU-3'）并在兩端添加限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以完成載體構(gòu)建。將合成的單鏈DNA oligo（干粉）溶解于退火緩沖液中（終濃度20 μm），90 ℃水浴15 min。冷卻至室溫后，形成帶有黏性末端的雙鏈。然后插入由XmaⅠ/SmaⅠ酶切的慢病毒GV110載體（購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物公司），并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、病毒感染及篩選穩(wěn)定敲減細(xì)胞株：結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116在37 ℃、5%CO2且濕度飽和條件下，使用含10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素的McCoy's 5A培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

根據(jù)病毒感染說明書，細(xì)胞密度達(dá)到30%~40%時(shí)吸去培養(yǎng)基，換為新培養(yǎng)基，量為原培養(yǎng)基的一半，加入Polybrene（50 μg/mL）和用ENI.S稀釋SRSF7-shRNA和control-shRNA病毒，8～12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。72～96 h熒光顯微鏡下觀察觀察GFP表達(dá)效率。加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每24 h更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，2 d傳代1次，0.25%胰酶消化傳代，傳代3~4次后收集細(xì)胞。

1.2.3 裸鼠的飼養(yǎng)與細(xì)胞接種

1.2.3.1 裸鼠的飼養(yǎng)：隨機(jī)分組，每組5只，SPF無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，恒溫、恒濕、清潔、無特殊病原體，每3 d定期更換墊料，清潔飲用水、飼料供裸鼠自由攝入。

1.2.3.2 細(xì)胞接種：取處于對(duì)數(shù)期細(xì)胞用胰酶消化，經(jīng)離心后收集細(xì)胞，用無血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，控制每毫升細(xì)胞數(shù)1×107/mL。使用刻度為1 mL的注射器抽取處理好的細(xì)胞懸液0.2 mL，待皮下注射使用。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別注射穩(wěn)定敲低SRSF7和轉(zhuǎn)染空載體的HCT116細(xì)胞。觀察待成瘤后每天測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑和短徑，腫瘤體積計(jì)算方式：體積V（mm3）＝長(zhǎng)徑（L）×短徑（W）2/2。

1.2.4 瘤體分離：待腫瘤長(zhǎng)到1~1.5 cm3時(shí)，采取脫頸處死裸鼠。用實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械對(duì)腫瘤進(jìn)行腫瘤取材。將腫瘤浸入生理鹽水中，將做石蠟切片的部分取材后浸入4%多聚甲醛，其余部分做RNA提取，然后分別打開胸腔、腹腔繼續(xù)觀察。

1.2.5 組織RNA提取和Real-time PCR：將腫瘤組織放在預(yù)冷的研缽，加入適量液氮。用Trizol法提取腫瘤內(nèi)的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為條件為94 ℃預(yù)變性30 s循環(huán)1次，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次。本實(shí)驗(yàn)中所使用引物序列如下：上游引物序列：ATGCTTATGATTGTCATCGTTACAGC，下游引物序列：GGAGATGCTGACCTTGACCTTC。

1.2.6 標(biāo)本制作及免疫組化染色：將腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。石蠟切片經(jīng)過常規(guī)烤片、烘片處理后進(jìn)行抗原修復(fù)，50 mL/L的牛血清白蛋白（BSA）封閉20~25 min后加入一抗37 ℃孵育1 h。PBS沖洗2 min×3次后，二抗孵育37 ℃ 20 min，然后使用DAB顯色劑顯色。蘇木素染色，封片。使用Image-J軟件對(duì)不同切片的染色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7 HE染色：切片制作完成后，入Coverstainer全自動(dòng)HE染色封片機(jī)進(jìn)行染色，依次經(jīng)過烤片、二甲苯3 min×2次、100%乙醇1 min×2次、70%乙醇1 min、流水沖洗1 min、蘇木精1 min 30 s、流水沖洗1 min、蒸餾水1 min、藍(lán)化液1 min、流水沖洗1 min、95%乙醇1 min、伊紅2 min、100%乙醇1 min×3次、二甲苯2 min×3次，封片后結(jié)束HE染色程序。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS17.0和GraphPad Prism6.02統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的差異統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)；P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

圖1 敲減SRSF7基因后，裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線

圖2 移植瘤SRSF7 RNA的表達(dá)水平的檢測(cè)

圖3 HE染色和免疫組化Ki-67、cleaved Caspase-3在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)（×40）

2 結(jié) 果

2.1 SRSF7shRNA慢病毒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116及篩選：我們成功構(gòu)建了SRSF7shRNA慢病毒，感染HCT116細(xì)胞后，篩選穩(wěn)定敲低SRSF7細(xì)胞株，其中shCtrl是對(duì)照組，sh-SRSF7是實(shí)驗(yàn)組。選出生長(zhǎng)狀態(tài)良好及穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞。

2.2 SRSF7移植瘤動(dòng)物模型的建立：裸鼠在接種1周后肉眼便可見皮下有一約0.1 cm3大小的腫塊結(jié)節(jié)。每天觀察，分別記錄成瘤時(shí)間和瘤體的體積。繪制移植瘤的生長(zhǎng)曲線，由圖1可見，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的瘤體體積及生長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減慢，有顯著差異（P＜0.05）。

2.3 SRSF7mRNA表達(dá)水平的鑒定：采用Real-time PCR實(shí)驗(yàn)分析移植瘤中SRSF7 mRNA的表達(dá)情況，由圖2結(jié)果顯示SRSF7在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 移植瘤免疫組化染色的檢測(cè)：結(jié)直腸癌腫瘤動(dòng)物模型建立后，分別取移植瘤進(jìn)行HE染色和Ki-67、cleaved Caspase-3的免疫組化染色。由圖3結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，核大深染，核分裂像多見，排列為不規(guī)則的細(xì)胞結(jié)構(gòu)；統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)組的Ki-67表達(dá)陽性率較對(duì)照組減少66%；同時(shí)觀察到實(shí)驗(yàn)組的cleaved Caspase-3表達(dá)陽性率較對(duì)照組增加37%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤動(dòng)物水平的研究相比較腫瘤細(xì)胞水平更能模擬人體內(nèi)環(huán)境的生長(zhǎng)情況。因此，在細(xì)胞水平的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物水平的研究是腫瘤研究和治療的重要一步。

腫瘤的動(dòng)物模型包括自發(fā)腫瘤模型、誘發(fā)腫瘤模型、同種移植腫瘤模型、異種移植腫瘤模型等[6]，其中異種移植模型是目前最常用于研究惡性腫瘤的方法，其常用的荷瘤動(dòng)物是免疫缺陷動(dòng)物[7]。由于裸鼠具有免疫缺陷的特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)條件下，一般不排斥來自異種動(dòng)物的細(xì)胞或組織移植，因此可以作為移植人類惡性腫瘤的接受體[8]。目前，常用于建立結(jié)直腸癌移植瘤動(dòng)物模型的方法包括細(xì)胞移植和組織移植，根據(jù)其接種部位的不同，又可以分為皮下移植和原位移植[9]。其中，通過將結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于免疫缺陷動(dòng)物皮下所建立的皮下移植瘤模型，是目前腫瘤研究中應(yīng)用最早和最為廣泛的，具有操作簡(jiǎn)單、成瘤率較高，便于觀察腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)情況等優(yōu)點(diǎn)[10]。

Pre-mRNA選擇性剪接是基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要機(jī)制，通過選擇性剪接可以產(chǎn)生不同的mRNA異構(gòu)體，從而翻譯出不同的蛋白質(zhì)[11]。剪接因子SRSFs可通過結(jié)合在pre-mRNA上的增強(qiáng)子上，或是競(jìng)爭(zhēng)RNA結(jié)合位點(diǎn)而影響選擇性剪接[12]。有研究報(bào)道，SRSF7作為一種在腫瘤中高表達(dá)的原癌基因，通過細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑P21的表達(dá)水平來影響細(xì)胞的增殖[13]。

Ki-67是應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一[14]，檢測(cè)Ki-67是評(píng)估人類各種組織增殖分化的簡(jiǎn)單而可靠的方法。Cleaved Caspase-3是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一，是細(xì)胞凋亡早期階段激活的關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起中心環(huán)節(jié)作用[15]，可以評(píng)估人類各種組織的凋亡情況。本實(shí)驗(yàn)選取這兩種常用的指標(biāo)進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Ki-67蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，而cleaved Caspase-3表達(dá)較對(duì)照組減少。說明實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖活性小于對(duì)照組，而凋亡增加，從而證實(shí)敲減SRSF7基因?qū)δ[瘤的生長(zhǎng)與增殖具有抑制作用。

研究發(fā)現(xiàn)SRSF7敲低可以抑制HCT116細(xì)胞的增殖和的凋亡，在此基礎(chǔ)上，我們通過構(gòu)建SRSF7慢病毒顆粒，感染并篩選穩(wěn)定敲低SRSF7的HCT116，通過皮下注射BABL/c小鼠，成功建立結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型，通過觀察及測(cè)量，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積及生長(zhǎng)速度較對(duì)照組減慢；通過Real-time PCR檢測(cè)移植瘤中SRSF7的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，綜合以上研究結(jié)果，進(jìn)一步在動(dòng)物水平驗(yàn)證了敲減SRSF7具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。