孔藝璇 劉章心怡 張榮花 王 琳 衛(wèi)敬澤 甄永占 章廣玲,*

（1 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，河北 唐山063000；2 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；3 華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000）

肝纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解的不平衡導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織過(guò)度沉積，是多種原因引起的慢性肝病向肝硬化發(fā)展所經(jīng)歷共有的病理改變和必經(jīng)途徑[1]。目前研究表明，進(jìn)行抗纖維化治療可以顯著降低肝纖維化程度，可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化[2]。大黃酸（Rhein）是一種蒽醌類化合物，是大黃、何首烏、虎杖等傳統(tǒng)中藥的主要有效成分之一。研究表明大黃酸除具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3-4]、抗炎[5]、抗菌及調(diào)節(jié)腎功能等功效，還具有保肝和抗肝纖維化的藥理作用[6]，然而，水溶性較差的大黃酸，限制其進(jìn)一步應(yīng)用，為改善其水溶性，以賴氨酸作為溶劑對(duì)大黃酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造獲得水溶性較好的賴氨大黃酸。本研究采用膽總管結(jié)扎法建立大鼠肝纖維化模型，形成人為的肝外膽道梗阻，膽汁排泄障礙導(dǎo)致以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分合成增多，過(guò)多沉積在肝內(nèi)竇周間隙形成肝纖維化[7]。此模型與CCL4和DMN等藥物所致化學(xué)損傷動(dòng)物模型[8]相比有顯著差異，成模時(shí)間短且肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯壞死[9]，對(duì)抗肝纖維化研究中具有重要意義。本研究旨在比較RHL和大黃酸防治BDL肝纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器：由天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物研究所提供SD大鼠，雄性，在22 ℃恒溫、65%~70%的相對(duì)濕度環(huán)境中飼養(yǎng)適應(yīng)2 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。賴氨大黃酸自制，純度98%，相對(duì)分子質(zhì)量：430，室溫儲(chǔ)存； ALT、AST、TBA、TBIL試劑盒，HE染色試劑盒，Masson 染色試劑盒，羥脯氨酸試劑盒購(gòu)，RIPA裂解液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，α-SMA抗體，GAPDH一抗抗體、羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗，免疫組化試劑盒；F6/10-8G型FLUKO 超細(xì)勻漿機(jī)，5810R低溫高速離心機(jī)，Gemini EM熒光讀板機(jī)，BX63全自動(dòng)顯微鏡掃描系統(tǒng)，電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)，Rayto chemray 240全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型的建立：用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，解剖，在肝臟和十二指腸連接處找到膽總管，進(jìn)行分離，分別結(jié)扎膽總管近端和遠(yuǎn)端，從中間剪斷后關(guān)腹。假手術(shù)對(duì)照組剪開(kāi)腹腔后隨即關(guān)腹。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理：按動(dòng)物體質(zhì)量進(jìn)行分層隨機(jī)分為賴氨酸組、RHL 70 mg/（kg?d） 治療組、70 mg/（kg?d） 大黃酸組、模型組、對(duì)照組，每組4只。以灌胃的方法給藥，對(duì)照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)期間自由飲食、飲水。

1.2.3 收集標(biāo)本：藥物治療2周后收集標(biāo)本，術(shù)前大鼠空腹8 h，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，在開(kāi)腹后采集腹主動(dòng)脈的血液標(biāo)本2~3 mL，3000 r/min離心10 min，留取上層血清保存在-80 ℃冰箱待測(cè)ALT、AST、TBA、TBIL。留取大鼠肝臟組織，在冰上進(jìn)行操作，用在4 ℃預(yù)冷的0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗，縱切取3~4 mm厚的肝大葉中央部位的肝組織，10%中性甲醛固定。

1.2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)：全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，采用酶動(dòng)力學(xué)法測(cè)定ALT、AST，采用循環(huán)酶法測(cè)定TBA，采用偶氮反應(yīng)法測(cè)定TBIL。

1.2.5 肝組織病理學(xué)檢測(cè)：肝臟組織在10%中性甲醛中固定12 h以上，石蠟包埋，切片（厚度3 μm）做HE、Masson染色，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.6 肝組織Hyp含量測(cè)定：大鼠肝組織中Hyp含量嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，采用樣本堿水解法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 肝組織免疫組織化學(xué)染色（SP法）：肝臟組織在10%中性甲醛中固定12 h以上，石蠟包埋，切片（厚度3 μm）?？乖迯?fù)，SP 法免疫組織化學(xué)染色，DAB 顯色，用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。陽(yáng)性對(duì)照使用已知陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照使用PBS 代替一抗。細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.8 Western blotting 分析：RIPA裂解液提肝臟組織蛋白。12% SDSPAGE電泳將等量蛋白分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉2 h，加入抗α-SMA（1∶500），GAPDH（1∶1000）作為內(nèi)參，4 ℃過(guò)夜，洗膜，加二抗（1∶5000）孵育2 h，洗膜，按照1∶1混合適量的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑A液和B液，滴加在膜上（BeyotimeECL Plus），凝膠成像儀對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行掃描并分析結(jié)果。

表 1 各組大鼠生長(zhǎng)率、肝臟與體質(zhì)量比和血清生化檢測(cè)結(jié)果（n=4，±s）

表 1 各組大鼠生長(zhǎng)率、肝臟與體質(zhì)量比和血清生化檢測(cè)結(jié)果（n=4，±s）

注：aP<0.05，與假手術(shù)組相比；bP<0.05，與模型組相比；cP<0.05，與大黃酸組相比

組別 生長(zhǎng)率(daily%) 肝臟/體質(zhì)量(g/kg) ALT(U/L) AST(U/L) TBA(μmol/L) TBIL(μmol/L)賴氨酸 0.27±0.13 57.82±5.97 157.00±8.48 1263.00±103.41 177.33±22.37 163.39±14.91 RHL組 0.34±0.52 46.25±2.64 b 76.25±6.08 bc 822.25±80.40 bc 116.70±5.34 b 90.59±18.31 bc大黃酸 0.30±0.15 56.05±4.48 120.25±8.54 b 1270.75±70.11 153.53±16.70 151.17±18.89 b模型組 0.27±0.07 61.17±2.50 a 207.75±23.61 a 1348.50±72.45 a 197.67±12.13 a 178.51±14.15 a假手術(shù) 0.43±0.07 26.07±1.75 31.50±8.06 132.25±4.35 9.37±1.23 0

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生長(zhǎng)率、肝臟與體質(zhì)量比和血清生化檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組大鼠生長(zhǎng)率下降，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P>0.05），肝臟濕重與體質(zhì)量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，RHL組大鼠生長(zhǎng)率上升，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P>0.05），肝臟濕重與體質(zhì)量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；大黃酸組大鼠生長(zhǎng)率下降，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P>0.05），肝臟濕重與體質(zhì)量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯降低，僅ALT、TBIL 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；賴氨酸組大鼠生長(zhǎng)率、肝臟濕重與體質(zhì)量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL無(wú)明顯下降，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與大黃酸組比較，RHL 組大鼠生長(zhǎng)率上升，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P>0.05），肝臟濕重與體質(zhì)量的比值、ALT、AST、TBA、TBIL 明顯降低，僅ALT、AST、TBIL差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變：通過(guò)HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊有規(guī)則，可見(jiàn)完整肝小葉結(jié)構(gòu)，竇周間隙無(wú)膠原纖維增生；與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，并伴有匯管區(qū)大量纖維組織異常增生，增生的纖維組織呈寬帶狀伸展；賴氨酸組與模型組非常相似；各治療組大鼠肝細(xì)胞紊亂，但仍可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)，只有部分肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)有中等量纖維增生，并呈細(xì)帶狀向周?chē)煺梗慌c大黃酸組相比，RHL組肝細(xì)胞排列較整齊，匯管區(qū)增生的纖維組織較少。見(jiàn)圖1。

圖1 HE 染色檢測(cè)膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟組織病理改變（×200）

2.3 各組大鼠肝臟組織纖維成分分布情況：Masson 染色顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟組織中纖維含量顯著增多；與模型組相比，經(jīng)RHL和大黃酸治療后，大鼠肝臟組織中纖維含量顯著減少，且RHL組較大黃酸組纖維含量降低更顯著，見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠肝臟組織中Hyp含量：與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟組織中Hyp含量明顯增加（P<0.05）；與模型組相比，治療后大鼠肝組織中Hyp含量明顯減少，賴氨酸組無(wú)明顯差異（P >0.05），與大黃酸組相比，RHL組Hyp含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 Masson三色染色檢測(cè)膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟組織纖維分布（×200）

圖3 各組大鼠肝組織Hyp含量

2.5 各組大鼠肝臟組織切片α-SMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：免疫組化染色顯示，α-SMA在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中分布。對(duì)照組α-SMA少量表達(dá)在血管周?chē)?；模型組α-SMA大量在匯管區(qū)和纖維間隔表達(dá)，治療組可見(jiàn)均少量表達(dá)在纖維隔及匯管區(qū)且大黃酸組較RHL組表達(dá)量大，見(jiàn)圖4。

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)α-SMA在膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟組織中的分布（×200）

2.6 Western blot 檢測(cè)α-SMA 的表達(dá)：與對(duì)照組相比，模型組大鼠α-SMA的表達(dá)顯著增加；與模型組相比，治療組大鼠α-SMA的表達(dá)顯著減少（P<0.05），賴氨酸組無(wú)顯著改變（P>0.05），與大黃酸組相比，RHL組α-SMA的表達(dá)顯著減少（P<0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot 檢測(cè)α-SMA的表達(dá)

3 討 論

肝纖維化是機(jī)體對(duì)慢性肝損傷的主動(dòng)性修復(fù)反應(yīng)，其特征在于肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的異常增生和沉積，表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管化與肝小葉內(nèi)纖維化形態(tài)特征[8-9]。肝纖維化并不是一種獨(dú)立的疾病，其是各種慢性肝病向肝硬化及肝癌等發(fā)展的必然病理過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，BDL模型組大鼠生長(zhǎng)率降低、肝臟與體質(zhì)量比升高，生化檢測(cè)分析ALT、AST、TBA TBIL顯著升高，HE 染色未見(jiàn)完整肝小葉，肝細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則，并伴有纖維組織異常增生，提示BDL模型復(fù)制成功[10]。

在膽汁瘀積性肝纖維化形成過(guò)程中ECM異常增生與沉積是最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HE染色提示，各治療組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)，與大黃酸組相比，RHL的治療使肝細(xì)胞排列較整齊，匯管區(qū)增生的纖維組織較少。Masson 染色進(jìn)一步提示治療組大鼠肝臟組織中纖維含量降低且RHL組纖維含量低于大黃酸組。此外，由于Hyp是膠原纖維獨(dú)有的氨基酸，動(dòng)物肝組織中羥脯氨酸含量與肝纖維化程度呈正相關(guān)[11]，本研究中與模型組相比，各治療組大鼠肝組織中Hyp含量顯著減少，RHL組低于大黃酸組。上述病理改變證實(shí)了賴氨大黃酸和大黃酸均能夠減輕肝纖維化程度，減少ECM的異常增生和過(guò)度沉積，且賴氨大黃酸的作用優(yōu)于大黃酸。

此外，血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示，與模型組相比，RHL組大鼠的ALT、AST、TBA、TBIL顯著降低，大黃酸組僅ALT、TBIL顯著降低，提示RHL和大黃酸能較好地保護(hù)肝臟，改善肝功能；與大黃酸組相比，RHL組大鼠ALT、AST、TBIL指標(biāo)降低，提示賴氨大黃酸的保肝作用優(yōu)于大黃酸。

為了進(jìn)一步研究RHL和大黃酸在預(yù)防和治療膽汁淤積性肝纖維化中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的分布和表達(dá)變化。研究表明，肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，肝臟ECM的產(chǎn)生主要細(xì)胞來(lái)源是HSC[12]。HSC在正常情況下處于靜息狀態(tài)，在受到損傷后HSC被活化，表達(dá)α-SMA作為細(xì)胞活化標(biāo)志，并轉(zhuǎn)化成肌成纖維樣細(xì)胞，增強(qiáng)纖維的形成[13]，α-SMA表達(dá)量的大小與HSC的激活程度呈正比。本研究結(jié)果顯示，α-SMA廣泛分布于肝細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)；與模型組相比，RHL組和大黃酸組大鼠肝組織α- SMA的表達(dá)均下降，且RHL組的表達(dá)量低于大黃酸組，提示RHL和大黃酸能夠抑制HSC的激活，且RHL作用優(yōu)于大黃酸。

綜上所述，RHL和大黃酸通過(guò)對(duì)HSC激活的抑制，降低HSC活化的數(shù)量，減少ECM異常增生與沉積，而達(dá)到保護(hù)肝臟和治療肝纖維化作用，并且RHL對(duì)肝纖維化的療效優(yōu)于大黃酸。