陳 俊 嚴(yán) 爭(zhēng) 劉 凡

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院兒科，福建 福州 350009）

根據(jù)CD4+T細(xì)胞表面分子CD25表達(dá)水平的不同，可將其分為CD4+CD25low的Teff和CD4+CD25high的Treg。前者促進(jìn)免疫炎性反應(yīng)，后者是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞群[1]。CD4+CD25+Treg來(lái)源包括自然產(chǎn)生（nTreg）和誘導(dǎo)產(chǎn)生（iTreg）[2]?；罨腃D4+CD25+Treg主要通過(guò)細(xì)胞接觸抑制的方式抑制T細(xì)胞的活化和增殖[3]。激活的CD4+CD25+Treg可以殺傷CD4+和CD8+T細(xì)胞，減少T細(xì)胞活化；抑制抗原提呈細(xì)胞，使其不能激活效應(yīng)T細(xì)胞；抑制幼稚T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而向Treg轉(zhuǎn)化。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+特異高表達(dá)于CD4+CD25+Treg表面，沒(méi)有它的調(diào)節(jié)，將導(dǎo)致Treg缺乏及免疫調(diào)節(jié)功能紊亂[4]。Hori[5]等最近的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將攜帶Foxp3基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染未活化的CD4+CD25+-T細(xì)胞，可使CD25-T細(xì)胞的表型特征及功能特點(diǎn)與CD25+Treg細(xì)胞極為相似，因此Foxp3mRNA是與CD4+CD25+Treg產(chǎn)生和功能機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵因素。

1 資料與方法

1.1 病例選擇：將60例足月新生兒分為兩組。30例（對(duì)照組）為健康足月新生兒。30例（實(shí)驗(yàn)組）為妊娠期糖尿病母親嬰兒：母親均符合妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除母親孕前糖尿病史、妊娠期高血壓、甲亢、貧血、感染、結(jié)締組織病等情況；其中新生兒低血糖23例，治療后血糖均恢復(fù)正常；感染方面，新生兒肺炎13例，尿路感染1例，新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎3例，新生兒敗血癥3例，不明原因細(xì)菌感染4例，感染比例達(dá)80%。感染病例住院期間出現(xiàn)氣促、呼吸困難、青紫、血氧飽和度下降、腹脹、嘔吐、消化道出血等表現(xiàn)，除外先天心臟病、腸道閉鎖等先天發(fā)育異常情況，經(jīng)治療后，均治愈出院，無(wú)死亡病例。兩組在性別、胎齡、體質(zhì)量等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血Treg%檢測(cè)：兩組均于出生24 h內(nèi)抽取外周靜脈血2 mL加入肝素抗凝管。每1 mL全血先后加25 μL T-Cell Xtend溶液、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上層。離心22 min（低速冷凍離心機(jī)，型號(hào)KDC-2046）后棄上清液，先后加入1 mL AIM-V培養(yǎng)液、0.5 mLAIM-V培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。在培養(yǎng)板分別加入50 μL AIM-V液，抗原A，抗原B和陽(yáng)性對(duì)照液，再加入細(xì)胞稀釋工作液100 μL。在培養(yǎng)板上加入50 μL酶標(biāo)工作液，每孔加底物工作液50 μL，室溫反應(yīng)7 min。以蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，干燥后上機(jī)檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)PVDF膜上的斑點(diǎn)數(shù)目，除以加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出Treg比例。

1.2.2 外周血Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)：兩組均于出生24 h內(nèi)抽取外周靜脈血2 mL加入肝素抗凝管。①核酸提取步驟：a.RNA提?。喝】鼓?00 μL，放入到離心管中，加入紅細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，收集沉淀；先后加入1 mL核酸提取液、200 μL氯仿，離心5 min；吸取上層液體，先后加入異丙醇、75%乙醇，離心，棄上清，加入RNA-free的DEPC水溶解沉淀，得到樣本RNA。b.RNA逆轉(zhuǎn)錄：在20 μL體系中配置RT反應(yīng)液。②熒光定量：取2 μL DNA加入到18 μL Real Time PCR反應(yīng)體系中，收集溶解曲線。③實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：以Foxp3的拷貝數(shù)平均值為A，以內(nèi)參actin的拷貝數(shù)平均值為B，I=A/B，比較I數(shù)值大小則可比較樣本中Foxp3的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Treg組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Treg與Foxp3mRNA采用spearman雙變量相關(guān)分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組Foxp3mRNA比較

2 結(jié) 果

2.1 兩組Treg比例比較：Treg%為正態(tài)分布，獨(dú)立t檢驗(yàn)顯示二者方差相等（P=0.161>0.05），實(shí)驗(yàn)組Treg比例（3.7507±1.24942）%，對(duì)照組Treg比例（2.9713±1.53691）%，t=-2.155，P=0.035（P＜0.05），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組Treg%比較（±s）

表1 兩組Treg%比較（±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=30) 實(shí)驗(yàn)組(n=30) t值 P值Treg% 2.9713±1.53691 3.7507±1.24942 -2.155 0.035

2.2 兩組Foxp3mRNA比較：Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈非正態(tài)分布，利用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，對(duì)照組平均秩次21.22，總秩次636.5，實(shí)驗(yàn)組平均秩次39.78，總秩次1193.5，P=0.000<0.05，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3 兩組Treg與Foxp3mRNA相關(guān)分析：spearman相關(guān)分析顯示對(duì)照組Treg與Foxp3mRNA正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.564，P=0.001<0.01。實(shí)驗(yàn)組Treg與Foxp3mRNA正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.775，P=0.000<0.01。見表3。

表3 兩組CD4+CD25+Treg與Foxp3mRNA相關(guān)分析

3 討 論

近年來(lái)，關(guān)于CD4+CD25+Treg免疫調(diào)節(jié)的研究引起業(yè)界廣泛關(guān)注，其主要功能是抑制排斥反應(yīng)及影響T細(xì)胞的功能等，其細(xì)胞表面特異性高表達(dá)叉頭狀或翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因Foxp3mRNA，被認(rèn)為是其細(xì)胞發(fā)育及啟動(dòng)抑制功能的關(guān)鍵基因，在一定程度上可反映Treg的水平和功能活性[1]。

葉學(xué)和[6]、張美娟及陳真[7]等研究指出，Treg數(shù)量或者功能缺陷破壞了機(jī)體效應(yīng)性T細(xì)胞和Treg之間的平衡，使平衡向著效應(yīng)性T細(xì)胞激活、擴(kuò)增方向傾斜，進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫病。新生兒非特異性及特異性免疫功能本身就較年長(zhǎng)兒低下，CD4+CD25+Foxp3+Treg在新出生糖尿病母親嬰兒外周血中高表達(dá)，可能降低效應(yīng)T細(xì)胞的活化與增殖，并且可導(dǎo)致幼稚T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化，阻止其向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此Treg升高可能是糖尿病母親嬰兒感染概率增加的重要原因。

劉西鳳[8]等研究表明，Treg發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)胰島細(xì)胞的作用。Arpaia等研究指出，1型糖尿病患者接受直接輸注Treg的干預(yù)后，其C肽水平升高，胰島細(xì)胞功能得到改善。糖尿病母親嬰兒多數(shù)有低血糖情況，Treg高表達(dá)，可能刺激胰島細(xì)胞過(guò)度分泌胰島素，引起新生兒低血糖，另一現(xiàn)象，大多數(shù)低血糖患兒經(jīng)補(bǔ)充葡萄糖對(duì)癥處理后，低血糖很快糾正，故考慮糖尿病母親嬰兒Treg高表達(dá)是否為一過(guò)性，隨著新生兒年齡增長(zhǎng)及自身代謝調(diào)節(jié)改變，Treg表達(dá)水平漸恢復(fù)正常水平。

當(dāng)然，本研究例數(shù)偏少，數(shù)值可能存在偏差，存在不足的地方，以后需更多的研究數(shù)據(jù)支持這一理論。