姚晨濤 ，劉銘鈺 ，孫 曉 ，賈芳瑩 ，彭宇漩 ，姜興印 *

（1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學環(huán)境毒理研究中心，山東泰安 271018）

農(nóng)藥對控制作物病害、保證農(nóng)作物的高產(chǎn)豐收發(fā)揮著重要作用[1]，但農(nóng)藥的不合理使用也會對生態(tài)環(huán)境造成危害[2]。農(nóng)藥進入田間后，一部分會通過不同環(huán)境介質(zhì)匯集到水體中，降低水生生態(tài)環(huán)境的質(zhì)量，影響水生生態(tài)系統(tǒng)，甚至整個生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[3]。在我國未來，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)仍離不開農(nóng)藥。為了將農(nóng)藥使用造成的危害與風險降到最低，對農(nóng)藥進行毒性檢測已經(jīng)成為評價水環(huán)境質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。目前，生態(tài)風險評價已成為農(nóng)藥環(huán)境安全管理的有力技術支撐，是我國農(nóng)藥登記管理中必不可少的環(huán)節(jié)[4]。

斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是水體的初級生產(chǎn)者，它對生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分重要的作用[5]。大型溞（Daphnia MagnaStraus）屬于浮游甲殼類動物，以藻類為食，是水生生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要環(huán)節(jié)。因其生活周期短、繁殖快、對毒物敏感及易于在實驗室培養(yǎng)等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于水體環(huán)境污染監(jiān)測和水生生物毒性試驗和評價中[6]。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的消費者，在食物鏈上與人類的關系最密切。斑馬魚（Barchydanio reriovar）是一種小型熱帶淡水魚，因其價格低廉、容易獲得、管理飼養(yǎng)易行等諸多因素引起環(huán)保組織重視，現(xiàn)已經(jīng)將化學品對其急性、慢性毒性作為評價污染物對水生環(huán)境危害程度的指標[7]。

S-誘抗素（abscisic acid）是活性高、功能強大的植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[8-9]。其具有調(diào)節(jié)植物生長，改善農(nóng)作物品質(zhì)，提高作物生存能力等特性，廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的抗災減災、生態(tài)植被建設和農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)等領域。

關于S-誘抗素對3種水生生物的環(huán)境毒性評價尚未見報道，本試驗根據(jù)國家《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[10-13]研究S-誘抗素對3種水生生物的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1200 HPLC高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市定山湖檢測儀器廠）、QUINTIX125D-1CN型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）、甲醇（色譜純，美國Sigma公司）、98%S-誘抗素標準樣品（四川龍蟒福生科技有限責任公司）。

1.2 溶液配制

準確稱取98%S-誘抗素標準樣品0.025 51 g于小燒杯中，加入甲醇，移至50 mL容量瓶，定容，得500.0 mg/L的S-誘抗素儲備液。用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為100.0、50.0、20.0、10.0、2.0、1.0 mg/L的S-誘抗素標準溶液。

1.3 水樣采集與處理

藻類生長抑制試驗各濃度處理重復3次，分別于0 h、72 h在水體中部取樣；溞類急性活動抑制試驗各濃度處理重復4次，分別于0 h、48 h水體中部取樣；魚類急性毒性試驗各濃度處理重復3次，分別于0 h、96 h水體中部取樣，重復混合后過0.22 μm水系濾膜，直接進樣，分別檢測不同時間水中樣品含量。

圖1 S-誘抗素標準樣品色譜圖及標準曲線

1.4 HPLC液相色譜條件

液相色譜柱：Pgrandsil-STC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇＋水（體積比60∶40），甲酸調(diào)溶液pH值為3；檢測波長：260 nm；柱溫：25℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL。所用試劑和溶液進入色譜系統(tǒng)前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.5 測定

在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，注入數(shù)針標樣溶液，計算各針相對響應值的重復性，待相鄰2針S-誘抗素響應值變化≤1.5%時，再按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將待測樣品溶液的峰面積值代入下列公式計算，得溶液中的有效成分質(zhì)量分數(shù)。

式中：X為待測樣品溶液中有效成分質(zhì)量濃度，單位為mg/L；C為標準樣品溶液中有效成分質(zhì)量濃度，單位為mg/L；S1為待測樣品溶液峰面積值；S2為標準樣品溶液峰面積值。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的線性關系

S-誘抗素標準樣品色譜圖如圖1-A所示，出峰時間為9.283 min。以S-誘抗素標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，S-誘抗素線性回歸方程為y=100 982x＋6 935.1，相關系數(shù)R2=0.999 8，結(jié)果見圖1-B。試驗結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為1.0～100.0 mg/L時，S-誘抗素的質(zhì)量濃度與相應的峰面積呈現(xiàn)的線性關系良好。

2.2 精密度、準確度的測定

試驗期間，空白對照中未檢測出待測樣品。精密度的測定方法為：稱取空白樣品1.0 g，分別加入質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的S-誘抗素標準溶液，每個添加水平下每個樣品平行測定3次，結(jié)果見表1。S-誘抗素的標準偏差為0.86，變異系數(shù)為0.88%。

表1 98%S-誘抗素原藥精密度測定結(jié)果

準確度測定方法為：稱取空白樣品1.0 g，分別加入質(zhì)量濃度為2.0、50.0、100.0 mg/L 3個添加水平的S-誘抗素標準溶液，每個添加水平下每個樣品平行測定2次，結(jié)果見表2。S-誘抗素平均添加回收率為100.08%～100.40%。

表2 98%S-誘抗素原藥準確度測定結(jié)果

2.3 藻類生長抑制試驗水樣檢測結(jié)果

在98%S-誘抗素原藥對藻類生長抑制試驗期間，設計質(zhì)量濃度為2、3、4.5、6.75、10.125、15.188 mg/L時，S-誘抗素72 h實測濃度與設計濃度比值分別為91.35%～94.68%，結(jié)果見表3。S-誘抗素72 h的實測濃度均高于設計濃度的80%，因此該設計濃度可用于計算藻類生長抑制EC50值。

表3 藻類生長抑制試驗各處理藥液濃度測量數(shù)據(jù)

2.4 溞類急性活動抑制試驗水樣檢測結(jié)果

在98%S-誘抗素原藥對溞類急性活動抑制試驗期間，當設計質(zhì)量濃度為8、12、18、27、40.5、60.75 mg/L時，S-誘抗素48 h實測濃度與設計濃度比值分別為92.77%～95.42%，結(jié)果見表4。供試物48 h實測濃度均高于設計濃度的80%，因此此設計濃度可用于計算溞類急性活動抑制EC50值。

2.5 斑馬魚急性毒性試驗水樣檢測結(jié)果

在98%S-誘抗素原藥對斑馬魚急性毒性試驗期間，設計質(zhì)量濃度為100 mg/L時，0 h、96 h實測濃度與設計濃度比值分別為98.646%和96.673%，結(jié)果見表5。供試物96 h的實測濃度均高于設計濃度的80%，因此可用設計濃度為100 mg/L為計算溞類急性活動抑制LC50值。

表4 溞類急性活動抑制試驗各處理藥液濃度試驗數(shù)據(jù)

表5 斑馬魚急性毒性試驗各處理藥液濃度實驗數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法，以甲醇＋水（體積比為60∶40）為流動相，使用Pgrandsil-STC-C18液相色譜柱分離，紫外檢測器測定S-誘抗素質(zhì)量濃度。試驗結(jié)果表明，本分析方法準確度、靈敏度良好。

在98%S-誘抗素原藥對藻類生長抑制試驗、溞類急性活動抑制試驗和魚類急性毒性試驗期間，結(jié)果表明供試物的實測濃度均不低于設計濃度的80%，可用設計濃度來計算藻類生長抑制EC50值、溞類急性活動抑制EC50值和魚類急性毒性LC50值。