譚志承 薛 鵬 許 瑾 唐順明 沈興家

(1江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

“飲食有節(jié)，方能百歲，飲食自倍，腸胃乃傷”，自古以來(lái)，飲食限制一直作為一種既能延長(zhǎng)壽命又能改善生活質(zhì)量的方法[1]。飲食限制又稱熱量限制(calorie restriction，CR)，是指在保證生物體不發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良的條件下限制食量，達(dá)到延長(zhǎng)壽命的效果，并且能有效地防止生物功能惡化，防治和延緩與老齡相關(guān)疾病的發(fā)生[2]。1935年，MCCAY等[3]提出了著名的“麥卡效應(yīng)”，即減少大鼠正常食量的30%～50%能顯著延長(zhǎng)大鼠壽命。迄今為止，研究者先后在酵母、果蠅和靈長(zhǎng)類動(dòng)物等多種生物體中觀察到CR不同程度誘導(dǎo)壽命延長(zhǎng)的現(xiàn)象[4]。CR的這種作用，可降低癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病和2型糖尿病等與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生。隨著全球人口老齡化問(wèn)題的日益嚴(yán)重，關(guān)于CR機(jī)制的探索也成為了生命科學(xué)中長(zhǎng)久不衰的研究熱點(diǎn)。研究者們分別從能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥和自噬等生理生化水平進(jìn)行探索研究[5]，發(fā)現(xiàn)飲食限制的生物機(jī)體氧自由基生成與氧化損傷減少,血糖水平、非酶糖基化、代謝速率降低,代謝潛力保持[6]。到目前為止，長(zhǎng)壽分子水平的研究已有突破性的認(rèn)識(shí)，長(zhǎng)壽相關(guān)基因的研究結(jié)果逐步揭示了生理功能、代謝途徑等對(duì)長(zhǎng)壽的重要影響[7]。胰島素受體底物1-B基因(chico)是胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子通路(IGF-1)表達(dá)調(diào)控的一員，此信號(hào)通路被證明是第1個(gè)得以驗(yàn)證在不同物種中調(diào)控壽命的分子信號(hào)通路；組蛋白去乙酰酶基因(rpd3)所在的組蛋白去乙酰酶(sirtuins)通路能介導(dǎo)飲食限制下的壽命延長(zhǎng)[8]；脂代謝激素2基因(Akh2)調(diào)控糖代謝能直接參與營(yíng)養(yǎng)和能量代謝，從而影響生物體的壽命[9-10]。家蠶(Bombyxmori)是世界上最重要的大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是重要的鱗翅目模式生物，它的生命周期短、子代多、遺傳背景清楚，是研究延長(zhǎng)壽命機(jī)制的良好模型動(dòng)物。KELLOGG等[11]最早開(kāi)展了家蠶限食與壽命關(guān)系的研究，通過(guò)節(jié)律性地控制給桑次數(shù)使幼蟲的壽命延長(zhǎng)。1984年，王德厚[12]報(bào)道了不同程度的限食對(duì)家蠶壽命的影響，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，給食量越少，家蠶壽命越長(zhǎng)；在不同發(fā)育階段限食，都能使幼蟲壽命延長(zhǎng)，連續(xù)限食者延壽幅度更大。2010年，孔祥賓[13]調(diào)查證明，限食和家蠶胰島素信號(hào)系統(tǒng)基因的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí)，有研究者指出限食處理對(duì)家蠶幼蟲絲氨酸蛋白酶基因(SPs)與絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(serpins)表達(dá)敏感性有所不同，暗示限食對(duì)家蠶不同組織的影響有差異[14]。但是對(duì)限食為何能延長(zhǎng)家蠶壽命，相關(guān)的長(zhǎng)壽基因是如何調(diào)控壽命長(zhǎng)短，至今尚不清楚。

本試驗(yàn)選取家蠶二化性品系秋豐為材料，研究食量限制對(duì)家蠶的體質(zhì)量、壽命、生理生化指標(biāo)、壽命相關(guān)基因表達(dá)水平和生育繁殖能力的影響，為人類健康飲食研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試家蠶品系 本試驗(yàn)所用家蠶品系為秋豐，二化性，斑紋限性(雌蠶為普斑，雄蠶為素蠶),由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所育成并保存提供。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量SYBR@Premix Ex TaqTM試劑盒，均為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶、可溶性蛋白[含聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA，試劑盒中試劑A和試劑B共同配制而成的工作液)和蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液]、海藻糖、丙二醛檢測(cè)試劑盒，均為蘇州科銘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒，為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，為Roche公司(美國(guó))產(chǎn)品；UV-2600紫外分光光度計(jì)，為島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶限食模型的建立與限食對(duì)食下量、體質(zhì)量和壽命的影響調(diào)查 秋豐越年蠶種(解除滯育)或浸酸處理后的蠶種，25 ℃室內(nèi)自然光照催青。孵化后單蛾或雙蛾混合收蟻，25±1 ℃室內(nèi)自然光照下新鮮桑葉飼養(yǎng)，從2齡開(kāi)始將幼蟲隨機(jī)分為2組，一組自由采食(ad libitum feeding，簡(jiǎn)稱AL組)，每日給桑2次，保持24 h自由進(jìn)食時(shí)間；另一組限制給食(detary restriction，簡(jiǎn)稱DR組)，每日給桑1次，保持16 h自由進(jìn)食時(shí)間，即停食8 h，給食量以AL組食量的60%為宜。自4齡起按照斑紋將2組幼蟲雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，每組雌雄蠶各3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30頭蠶。后續(xù)研究均以此為模型。調(diào)查每日食下量、體質(zhì)量、齡期經(jīng)過(guò)等。

食下量調(diào)查：按“食下量=每日給桑量-幼蟲未食完的余桑量”公式計(jì)算食下量。其中，余桑量為折算成的鮮桑葉量。每次喂食前留取10 g鮮桑葉，至下次喂食前稱量，作為余桑量折算成鮮桑葉量的指標(biāo)[13]。

體質(zhì)量調(diào)查：2齡、3齡幼蟲體質(zhì)量在蛻皮完成眠起時(shí)稱量；4～5齡幼蟲每天稱量體質(zhì)量；化蛹第3天稱量體質(zhì)量。

齡期經(jīng)過(guò)調(diào)查：幼蟲期每個(gè)齡期經(jīng)過(guò)為上一齡期蛻皮完成至下一齡期蛻皮完成；蛹期經(jīng)過(guò)為熟蠶結(jié)繭至羽化為成蟲；成蟲期經(jīng)過(guò)為羽化至成蟲死亡。本文家蠶壽命為幼蟲期經(jīng)過(guò)、蛹期經(jīng)過(guò)和成蟲期經(jīng)過(guò)時(shí)間之和，即從幼蟲孵化到成蟲死亡的時(shí)間。

繁殖能力調(diào)查：采用雌蛾交尾后造卵數(shù)(產(chǎn)出卵和未產(chǎn)出卵之和)，雄蛾一次交尾、二次交尾是否正常來(lái)初步評(píng)估家蠶繁殖能力。

1.2.2 家蠶壽命相關(guān)基因的表達(dá)分析 分別取AL組和DR組家蠶5齡3 d的雌和雄幼蟲頭部、中腸、表皮、血淋巴、精巢/卵巢、絲腺、馬氏管和脂肪體，提取總RNA。采用相對(duì)定量方法(qPCR)，每組3次重復(fù)，分析不同給食條件下Bmchico(GeneID：101745072)、Bmrpd3(Gene ID：101744526)、BmAkh2(GeneID：100174839)基因的表達(dá)水平變化(表1)[13]。

表1 qRT-PCR引物

引物引物序列 (5′-3′)BmchicoF:TACCGAACCTCTGCTACCCATR:CCGTCGTAGTCTGCCTTCCGABmrpd3F:ATGCTGTAAATATACCCCTTCGTR:TCGTAAGTCCAACAGCGAGABmAkh2F:TACTTGTGTTGATTCTGTCCGR:TCTTCAGAGGAGCATCCATCGActin3F:CGGCTACTCGTTCACTACCR:CCGTCGGGAAGTTCGTAAG

1.2.3 家蠶部分生理生化指標(biāo)的檢測(cè) 分別取AL組和DR組家蠶5齡期雌雄幼蟲，酒精擦拭后尾足取血淋巴，將血淋巴收集在預(yù)先加入苯基硫脲的1.5 mL離心管中，用于檢測(cè)分析血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(soluble protein)和海藻糖(trehalose)等生理生化指標(biāo)。各生理生化指標(biāo)均按照試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定。

參見(jiàn)可溶性蛋白含量測(cè)定試劑盒，取稀釋200倍的待測(cè)樣品20 μL和配制好的BCA工作液(試劑 A 和 B 按照 50∶1的比例混合)1 000 μL混勻作為測(cè)定管，分別取蒸餾水20 μL和工作液1 000 μL混勻作為空白管，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL和工作液1 000 μL混勻作為標(biāo)準(zhǔn)管，于60 ℃水浴保溫30 min后測(cè)定562 nm 處吸光度值，按照“可溶性蛋白含量(mg/mL)=0.5×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)”計(jì)算待測(cè)樣品可溶性蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本文所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件(v7.04)。所有數(shù)值均表示為平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。本試驗(yàn)顯著性差異分析均采用Holm-Sidak，比較2組模型相同日齡相同性別的差異，顯著性水平P<0.05表示2組之間的比較具有顯著性差異，顯著性水平P<0.01表示2組之間的比較具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 限食對(duì)家蠶食下量、體質(zhì)量和壽命的影響

在上述限食模型下，統(tǒng)計(jì)了自2齡幼蟲限食開(kāi)始，到5齡結(jié)束(上蔟)期間的食下量。結(jié)果顯示，限食顯著減少幼蟲食下量。以5齡期為例，DR組食下量約為AL組的61.03%，2組食下量差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；而且，雌蠶食下量均高于雄蠶，符合生產(chǎn)實(shí)際(圖1-A)。

♀分別代表限制給食組雄、雌蠶；♀分別代表自由采食組雄、雌蠶；*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；圖2-4，表2-6相同。圖1 限食模型與自由采食模型家蠶5齡幼蟲日均食下量(A)、齡期經(jīng)過(guò)(B)、體質(zhì)量(C)和雌蛾造卵數(shù)(D)比較

從限食開(kāi)始，DR組每個(gè)齡期經(jīng)過(guò)時(shí)間均有不同程度的延長(zhǎng)，其中在5齡幼蟲和成蟲期經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)最明顯，綜合整個(gè)齡期(圖1-B)來(lái)看，雌蠶DR組比AL組延長(zhǎng)了132 h，雄蠶DR組比AL組延長(zhǎng)了130 h，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，表明限食能夠顯著延長(zhǎng)家蠶的壽命。

隨著限食時(shí)間的推移，DR組家蠶體質(zhì)量較AL組有明顯的減輕。DR組雌、雄幼蟲體質(zhì)量峰值分別為AL組雌、雄幼蟲的75.07%和70.30%，表明DR組家蠶發(fā)育周期中，體質(zhì)量始終達(dá)不到AL組幼蟲的峰值水平，限食減輕了家蠶的體質(zhì)量。蛹期3 d的DR組雌、雄蛹平均體質(zhì)量分別為AL組的63.34%和63.52%(圖1-C)，2組中雌蠶體質(zhì)量均大于雄蠶體質(zhì)量，這與食下量的調(diào)查結(jié)果一致。

對(duì)雌蛾交配后造卵數(shù)的調(diào)查結(jié)果(圖1-D)顯示，DR組和AL組雌蛾的造卵數(shù)量并沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明適度限食對(duì)家蠶生育繁殖沒(méi)有明顯的影響。

2.2 限食影響家蠶壽命相關(guān)基因的表達(dá)水平

2.2.1Bmchico基因表達(dá)水平的變化 家蠶幼蟲5齡3 d是蠶絲蛋白大量合成的時(shí)期，常用于家蠶生理毒理研究，我們用qRT-PCR技術(shù)分析了限食后5齡3 d幼蟲各組織中3個(gè)長(zhǎng)壽相關(guān)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，與AL組雌蠶相比，DR組雌蠶Bmchico基因表達(dá)水平在中腸和馬氏管中上調(diào)，在頭部、絲腺、卵巢和脂肪體中下調(diào)，其中在絲腺和脂肪體中顯著下調(diào)(圖2-A)，與限食降低蠶絲蛋白合成一致；DR組雄蠶Bmchico基因在表皮中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，在絲腺、精巢、脂肪體、馬氏管和血淋巴中的表達(dá)水平上調(diào)，但差異不顯著(圖2-B)。同時(shí)雌、雄對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Bmchico基因在雌蠶中表達(dá)水平較雄蠶高，推測(cè)Bmchico基因存在一定的性別特異性。

A.雌蠶，B.雄蠶；圖3-4相同。圖2 Bmchico在家蠶5齡3 d各組織中的表達(dá)水平

2.2.2Bmrpd3基因表達(dá)水平的變化 與AL組相比，DR組中雌蠶Bmrpd3在頭部和表皮中的表達(dá)水平下調(diào)但差異不顯著；在其余組織中均表現(xiàn)上調(diào)，其中在中腸、絲腺、脂肪體和馬氏管中顯著上調(diào)(圖3-A)。在DR組雄蠶中該基因在頭部、表皮、中腸的表達(dá)水平下調(diào)，在其余組織中表現(xiàn)為上調(diào)(圖3-B)。而且在雌、雄家蠶幼蟲中Bmrpd3基因的表達(dá)水平相近。

圖3 Bmrpd3在家蠶5齡3 d各組織中的表達(dá)水平

圖4 BmAkh2在家蠶5齡3 d各組織中的表達(dá)水平

2.2.3BmAkh2基因表達(dá)水平的變化 DR組雌蠶BmAkh2在各個(gè)組織中的表達(dá)水平均表現(xiàn)出不同程度的下調(diào)，在絲腺中下調(diào)的幅度最大，達(dá)到顯著水平(圖4-A)；DR組雄蠶BmAkh2在表皮中的表達(dá)水平顯示上調(diào)，在其余組織中的表達(dá)水平顯示下調(diào)，在絲腺、精巢、馬氏管和血淋巴中的表達(dá)水平差異顯著(圖4-B)。BmAkh2基因整體上表達(dá)水平較低，在不同組織和不同性別中的表達(dá)差異大，顯示出一定的性別和組織特異特性。

2.3 限食對(duì)家蠶5齡幼蟲血淋巴部分生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1 超氧化物歧化酶活性的變化 超氧化物歧化酶對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用，從表2可以看出，AL組超氧化物歧化酶的活力從5齡1 d開(kāi)始上升，在5齡4 d(盛食期)到達(dá)極值后開(kāi)始下降；而DR組超氧化物歧化酶活力變化從5齡1 d開(kāi)始，一直呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在5齡6 d超過(guò)AL組家蠶。

表2 超氧化物歧化酶在5齡家蠶血淋巴中的活力

時(shí)間/d樣本數(shù)/個(gè)超氧化物歧化酶活力/(U/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d313.32±1.8714.13±2.6412.71±1.8014.69±0.995齡2 d316.08±2.3716.41±1.5614.96±2.7013.39±1.215齡3 d318.64±4.5318.39±4.4116.83±0.8616.64±2.455齡4 d320.90±1.3219.24±1.6119.60±1.6818.75±0.155齡5 d320.37±0.6619.16±3.0217.24±1.14?18.65±3.585齡6 d317.40±1.1115.07±2.6619.37±2.4420.45±3.525齡7 d321.74±2.5022.37±1.645齡8 d323.99±4.0124.02±2.62日均-17.79±1.9817.07±2.6518.31±2.1418.62±2.02

日均為5齡期酶活總量除以5齡期天數(shù)；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；表3-6相同。

2.3.2 過(guò)氧化氫酶活性的變化 過(guò)氧化氫酶是反映生物體氧化水平的指標(biāo)之一，AL組5齡期血淋巴中過(guò)氧化氫酶活力隨著時(shí)間的推移持續(xù)下降，而DR組活力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，至5齡6 d到達(dá)峰值，末期再次降低(表3)。而且DR組過(guò)氧化氫酶活力均高于AL組同性別的家蠶，在同一模型中過(guò)氧化氫酶活力雌蠶均高于雄蠶，表明該酶活力存在性別差異。

表3 過(guò)氧化氫酶在5齡家蠶血淋巴中的活力

時(shí)間/d樣本數(shù)/個(gè)過(guò)氧化氫酶活力/(U/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d332.96±3.8834.47±2.8139.09±1.6742.65±4.665齡2 d331.08±3.7934.74±3.9429.64±1.7435.18±2.875齡3 d332.18±2.1937.71±2.9529.98±1.7831.41±1.405齡4 d326.28±1.9329.32±4.3935.88±1.21?33.22±1.645齡5 d328.67±1.8332.49±3.1636.41±1.12?39.58±1.905齡6 d326.78±1.0334.68±3.8836.46±1.64?45.23±1.615齡7 d327.82±1.4825.82±1.715齡8 d334.11±2.9336.21±1.95日均-29.66±2.4433.90±3.5233.67±1.7036.16±2.22

2.3.3 丙二醛含量的變化 丙二醛是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，能直接反映機(jī)體脂質(zhì)氧化水平。在AL組家蠶血淋巴中丙二醛濃度為0.50～0.92 nmol/mL，說(shuō)明正常蠶體也存在較弱的脂質(zhì)氧化作用，在5齡期隨發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。與AL組家蠶相比，DR組家蠶血淋巴中丙二醛平均含量更低，同樣隨發(fā)育進(jìn)程逐步下降(表4)，但2組間差異未到達(dá)顯著水平。

表4 丙二醛在5齡家蠶血淋巴中的含量

時(shí)間/d樣本數(shù)/個(gè)丙二醛含量/(nmol/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d30.68±0.120.83±0.070.90±0.120.65±0.165齡2 d30.68±0.070.76±0.150.64±0.130.80±0.205齡3 d30.74±0.190.62±0.130.55±0.100.39±0.205齡4 d30.71±0.110.68±0.060.52±0.160.44±0.10?5齡5 d30.92±0.230.79±0.260.48±0.180.37±0.075齡6 d30.52±0.190.50±0.080.30±0.100.36±0.105齡7 d30.34±0.030.26±0.035齡8 d30.67±0.300.80±0.38日均-0.71±0.150.70±0.130.66±0.130.61±0.18

2.3.4 可溶性蛋白含量的變化 可溶性蛋白包含昆蟲發(fā)育過(guò)程中的各種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，其性質(zhì)和數(shù)量隨著發(fā)育階段改變，從側(cè)面反映著昆蟲的發(fā)育狀態(tài)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期限食，AL組雄蠶血淋巴中可溶性蛋白平均含量達(dá)到119.33 mg/mL，DR組雄蠶為124.50 mg/mL，相差不大；而AL組和DR組雌蠶血淋巴中可溶性蛋白平均含量相差約10 mg/mL(表5)，說(shuō)明限食對(duì)可溶性蛋白含量影響在雌蠶中表現(xiàn)得更為顯著。

表5 可溶性蛋白在5齡家蠶血淋巴中的含量

時(shí)間/d樣本數(shù)/個(gè)可溶性蛋白含量/(mg/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d3112.56±6.97104.56±1.97160.27±2.28 ?152.87±1.64 ?5齡2 d3102.27±2.82134.27±2.82116.47±2.28?134.14±4.145齡3 d3112.71±1.31122.48±2.82118.99±1.79?120.54±5.655齡4 d3110.99±1.79150.81±8.48116.12±3.94120.71±1.31?5齡5 d3132.71±1.31150.84±5.45112.27±2.28?116.56±1.97?5齡6 d3148.12±3.94182.26±4.08118.84±2.45?122.84±2.45?5齡7 d3124.42±2.62130.89±1.795齡8 d3132.56±1.97148.76±1.97日均-119.33±3.02140.33±4.33124.50±2.45130.25±2.62

2.3.5 海藻糖含量的變化 海藻糖是家蠶的血糖，也是家蠶生理活動(dòng)的主要能源物質(zhì)。在血淋巴海藻糖測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，DR組和AL組家蠶均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，5齡3 d達(dá)到峰值(AL組：10.90 mg/mL；DR組：7.62 mg/mL)。但DR組整體海藻糖平均含量更低，并在5齡6 d出現(xiàn)了含量上升的現(xiàn)象(表6)。

表6 海藻糖在5齡家蠶血淋巴中的含量

時(shí)間/d樣本數(shù)/個(gè)海藻糖含量/(mg/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d36.52+1.656.51±1.675.33±0.435.12±0.975齡2 d38.53±0.646.92±1.335.93±0.506.42±0.055齡3 d310.84±0.4610.95±0.46 7.32±0.16?7.92±0.35?5齡4 d38.76±0.717.95±1.944.77±0.24?5.06±1.46?5齡5 d37.49±1.466.18±0.824.64±0.89?4.71±0.545齡6 d37.38±0.645.94±0.616.69±1.296.68±1.61

續(xù)表6

3 討論

3.1 家蠶限食模型

動(dòng)物限食模型的利用，解決了醫(yī)學(xué)和健康性試驗(yàn)人體的困難以及倫理問(wèn)題。家蠶作為鱗翅目昆蟲模式生物，子代多、生命周期短、遺傳背景清楚、繁殖能力強(qiáng)，是研究壽命較好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。為了探究限食延長(zhǎng)壽命的機(jī)制，我們以家蠶為試驗(yàn)材料，限食組給食量為自由采食組的61.03%，符合其他動(dòng)物模型限食標(biāo)準(zhǔn)(60%)[15]。通過(guò)定時(shí)限食，家蠶的壽命得到顯著延長(zhǎng)。根據(jù)嚙齒類動(dòng)物常用的體質(zhì)量、血糖水平和壽命長(zhǎng)短等指標(biāo)判斷[16]，我們的家蠶限食模型建立成功。限食可延長(zhǎng)家蠶的壽命，其中延長(zhǎng)最明顯的是5齡期和成蟲期，分別占總延長(zhǎng)時(shí)間的36.64%和18.32%。而且家蠶限食后未觀察到如嚙齒類動(dòng)物由于長(zhǎng)期禁食生殖力下降的現(xiàn)象[1]，雌蠶的造卵數(shù)沒(méi)有明顯變化，雄蛾交尾正常，說(shuō)明適度限食對(duì)家蠶生育繁殖沒(méi)有明顯的影響。

3.2 限食對(duì)家蠶壽命相關(guān)基因表達(dá)的影響

一直以來(lái)，人們都在尋找延緩衰老的有效途徑，研究方向由原來(lái)的宏觀水平到細(xì)胞、基因水平，再到基因功能，希望通過(guò)抑制或調(diào)控長(zhǎng)壽相關(guān)基因來(lái)延緩衰老，達(dá)到健康長(zhǎng)壽的目的[17]。我們從家蠶中選取了3個(gè)黑腹果蠅中調(diào)控壽命相關(guān)的同源基因，分析了它們?cè)诩倚Q不同組織中的表達(dá)情況。chico基因編碼胰島素受體底物1-B，該底物在胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)信號(hào)通路扮演重要角色，而胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路是經(jīng)典的壽命調(diào)節(jié)相關(guān)通路[18]，該信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物中，在進(jìn)化上高度保守并與各種正常生理活動(dòng)及多種疾病發(fā)生密切相關(guān)[19-20]。CLANCY等[18]在果蠅中對(duì)chico基因進(jìn)行了誘變，發(fā)現(xiàn)果蠅平均壽命在突變純合子中延長(zhǎng)了48%，在突變雜合子中延長(zhǎng)了36%，在本試驗(yàn)中，與AL組家蠶相比，DR組Bmchico在雌蠶絲腺、脂肪體和雄蠶表皮中的表達(dá)水平都顯著下調(diào)，這與chico基因在果蠅中的研究結(jié)果一致，表明限食通過(guò)誘導(dǎo)chico基因的表達(dá)水平下調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)壽命的效果，而在其他組織中Bmchico的表達(dá)水平下調(diào)不明顯甚至有些組織中還出現(xiàn)上調(diào)，也說(shuō)明飲食限制通過(guò)chico來(lái)調(diào)節(jié)壽命的程度和方式在不同物種間有所不同。

rpd3是一類保守的組蛋白去乙酰酶，大量的試驗(yàn)證明，在果蠅中rpd3基因的突變會(huì)導(dǎo)致果蠅壽命的延長(zhǎng)[21]。同時(shí)，rpd3作為一類組蛋白去乙酰化酶在表觀遺傳調(diào)控方面也起著至關(guān)重要的作用[22]。據(jù)報(bào)道，劉易斯-卡茨醫(yī)學(xué)院揭示表觀遺傳學(xué)隨年齡而變化的速度與物種的壽命相關(guān)，而限食減緩了這一變化進(jìn)程，甲基化程度與壽命之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。換句話說(shuō)，表觀遺傳變化越大，發(fā)生的速度越快，物種的壽命就越短[23]。在本試驗(yàn)中，在2組家蠶的各個(gè)組織中我們都觀察到不同程度的表達(dá)差異，我們推測(cè)因?yàn)樯矬w衰老并不是同時(shí)發(fā)生的，各個(gè)組織中的衰老程度都會(huì)有所不同，表觀遺傳在各個(gè)組織中的變化速度不同，造成rpd3在不同組織中的表達(dá)情況有所差異，暗示著限食能延長(zhǎng)壽命，也可能是生物體表觀遺傳調(diào)節(jié)的結(jié)果。

已有研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝在飲食限食延長(zhǎng)壽命中起關(guān)鍵作用。昆蟲脂代謝激素(Akh2)是一種代謝性神經(jīng)肽，主要以其在需要能量的活動(dòng)(如飛行和運(yùn)動(dòng))中動(dòng)員能量底物，它介導(dǎo)了昆蟲體內(nèi)糖類和脂類代謝調(diào)控[24]。在DR組家蠶脂肪體中，BmAkh2的表達(dá)水平普遍下調(diào)，這與果蠅中的試驗(yàn)結(jié)果一致，表明，Akh2表達(dá)水平下降導(dǎo)致調(diào)動(dòng)其能源的速度越慢，家蠶的存活時(shí)間就越長(zhǎng)，同時(shí)限食誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝的改變也可能為我們治療肥胖癥等疾病帶來(lái)新的曙光[19]。

3.3 限食對(duì)家蠶主要生理生化指標(biāo)的影響

生物機(jī)體氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡與其健康、衰老和疾病的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶作為抗氧化防御系統(tǒng)中的重要組成部分，能有效地清除機(jī)體中的氧自由基防止其累積對(duì)細(xì)胞造成氧化傷害。通過(guò)限制食量，我們發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活力在DR組家蠶血淋巴中均有上升的趨勢(shì)，其最高水平均超過(guò)AL組家蠶水平，同時(shí)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛含量下降。表明限食降低了蠶體脂質(zhì)氧化水平，加速了自由基的清除，使機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力提高，從而延緩細(xì)胞的衰老，延長(zhǎng)生物體的壽命[25-26]?？扇苄缘鞍资侵匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是代謝系統(tǒng)運(yùn)作的各種關(guān)鍵酶的主要來(lái)源，DR組雌蠶血淋巴可溶性蛋白含量較AL組雌蠶血淋巴低預(yù)示著限食可能導(dǎo)致生物體較低的代謝率，并將大部分營(yíng)養(yǎng)和能量代謝用來(lái)繁殖后代。同時(shí)海藻糖作為家蠶的主要能源物質(zhì)，大部分時(shí)候在血淋巴中穩(wěn)定存在，而在DR組家蠶中，海藻糖平均含量較AL組家蠶低且含量水平發(fā)生變化，暗示著限食可能改善了家蠶血糖的調(diào)節(jié)方式，這種調(diào)節(jié)方式很可能為人類2型糖尿病提供新的干預(yù)治療方法。

限制飲食對(duì)于生物體壽命的延長(zhǎng)顯示出明顯的效果，大量報(bào)道指出限制飲食也是預(yù)防和治療各種與老年相關(guān)疾病的有效手段[2]。然而限制飲食并不是每個(gè)人都能接受的長(zhǎng)壽方案，我們利用家蠶作為模型，研究限食對(duì)壽命、繁殖和生理生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明限食不僅可以延長(zhǎng)家蠶的壽命，不影響繁殖，而且主要生理生化指標(biāo)得到改善或提高，給未來(lái)長(zhǎng)壽機(jī)制研究提供了新的線索和借鑒。