吳建軍 羅 源 董 磊

(湖北省武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院1 泌尿外科，2 腫瘤科，武漢市 430050，電子郵箱：zengjg2@163.com)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，男性發(fā)病率較高，以無(wú)痛性肉眼血尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)，部分患者臨床表現(xiàn)不明顯，診斷時(shí)已為晚期[1-2]。晚期膀胱癌的治療以局部腫瘤切除為主，術(shù)后輔以膀胱灌注化療防止復(fù)發(fā)，但不同灌注化療方案可帶來(lái)不同治療結(jié)局[3]。羥喜樹(shù)堿、吡柔比星是目前臨床應(yīng)用最多的膀胱癌灌注化療藥物。本研究比較吡柔比星單獨(dú)灌注化療與吡柔比星聯(lián)合羥喜樹(shù)堿灌注化療對(duì)晚期膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，為臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2014年1月至2017年11月在本院治療的77例晚期膀胱癌患者臨床資料，患者均采用膀胱灌注化療。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合原發(fā)性膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，腫瘤分期為晚期；(2)均為首次確診；(3)可耐受化療毒副作用；(4)預(yù)計(jì)生存時(shí)間≥3月；(5)患者及家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他組織臟器原發(fā)性惡性腫瘤者；(2)合并全身感染性疾病者；(3)出現(xiàn)化療藥物嚴(yán)重毒副反應(yīng)并導(dǎo)致治療中斷者；(4)治療期間死亡、數(shù)據(jù)缺失者。根據(jù)膀胱灌注化療方案將患者分為吡柔比星組40例與聯(lián)合治療組37例，其中吡柔比星組男23例、女17例，年齡48～79(58.72±8.82)歲，病程(1.94±0.32)年，手術(shù)時(shí)間(92.93±11.84)min；聯(lián)合治療組中男20例、女17例，年齡45～78(59.23±8.23)歲，病程(2.08±0.36)年，手術(shù)時(shí)間(95.12±12.18)min。兩組患者一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 兩組患者均采用膀胱部分切除術(shù)治療，術(shù)后開(kāi)始規(guī)律膀胱灌注化療。吡柔比星組采用吡柔比星膀胱灌注化療：吡柔比星(海正輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20045983)30 mg+5%葡萄糖注射液40 mL，膀胱灌注30 min后方可排尿。1次/周，連續(xù)灌注化療8周后改為每月1次，再繼續(xù)治療10次，共18次。聯(lián)合治療組采用吡柔比星聯(lián)合羥喜樹(shù)堿膀胱灌注化療：吡柔比星30 mg+羥喜樹(shù)堿(貴州漢方制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20033960)20 mg+5%葡萄糖注射液40 mL，膀胱灌注30 min后方可排尿。1次/周，連續(xù)灌注化療8周后改為每月1次，再繼續(xù)治療10次，共18次。

1.3 膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè) 兩組患者完成所有膀胱灌注化療后，行膀胱鏡檢查并在膀胱鏡下剪取約1 mm3的病變組織標(biāo)本，生理鹽水沖洗后在液氮內(nèi)短暫冷凍，取出后在-80℃冰箱保存。采用熒光定量PCR法檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞相關(guān)增殖基因、侵襲基因及凋亡基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。增殖基因包括三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白E亞族成員1(adenosine triphosphate-binding cassette sub-family E member 1，ABCE1)、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α2(karyopherin alpha 2，KPNA2)、線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)、yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein，YAP)、DKK2、人源性長(zhǎng)壽保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)。侵襲基因包括整合素相關(guān)激酶(integrin-linked kinase，ILK)、核因子-κBp65(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65)、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)。凋亡基因包括 Livin、Bad、Survivin、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)、BAG-1。PCR試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司(批號(hào)：CW2601S)，PCR反應(yīng)后自動(dòng)生成循環(huán)曲線和循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算基因mRNA表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者膀胱癌細(xì)胞增殖基因相對(duì)表達(dá)量比較 聯(lián)合治療組ABCE1、KPNA2、MRPS5、YAP的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于吡柔比星組，DKK2、LASS2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于吡柔比星組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者膀胱癌細(xì)胞增殖基因相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

2.2 兩組患者膀胱癌細(xì)胞侵襲基因相對(duì)表達(dá)量比較 聯(lián)合治療組ILK、NF-κBp65、HMGB1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于吡柔比星組，PPARγ的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于吡柔比星組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者膀胱癌細(xì)胞侵襲基因相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

2.3 兩組患者膀胱癌細(xì)胞凋亡基因相對(duì)表達(dá)量比較 聯(lián)合治療組Livin、Survivin、BAG-1 的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于吡柔比星組，Bad、Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于吡柔比星組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者膀胱癌細(xì)胞凋亡基因相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)

3 討 論

晚期膀胱癌的治療以局部腫瘤切除聯(lián)合膀胱灌注化療為主，化療方案的選擇可能直接影響患者預(yù)后[5]。羥喜樹(shù)堿及吡柔比星具有降低腫瘤細(xì)胞惡性活力的作用，應(yīng)用于不同惡性腫瘤的治療中可獲得較好的療效。有學(xué)者推薦將吡柔比星與羥喜樹(shù)堿聯(lián)合用于晚期膀胱癌患者的膀胱灌注化療中，以提高療效[6-7]。

晚期癌癥患者的癌細(xì)胞增殖旺盛，是腫瘤體積不斷擴(kuò)大及機(jī)體腫瘤負(fù)荷持續(xù)增加的基礎(chǔ)，多種增殖相關(guān)基因參與其中。ABCE1是參與腫瘤形成及發(fā)展的新型調(diào)控分子，可阻斷抗病毒2-5A/RNase L通路，抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖，在多種惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)[8-9]。KPNA2是一種相對(duì)保守的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)多條信號(hào)通路的下游分子表達(dá)，目前已經(jīng)在乳腺癌、卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)其異常高表達(dá)，細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)沉默KPNA2表達(dá)可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力[10-11]。MRPS5可通過(guò)線粒體代謝機(jī)能障礙途徑調(diào)控小鼠壽命，與機(jī)體衰老、腫瘤發(fā)生易感性均相關(guān)[12]。YAP屬于Hippo信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)磷酸化修飾作用在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，目前已經(jīng)證實(shí)其在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)異常上調(diào)，且具體表達(dá)量與腫瘤分期、預(yù)后密切相關(guān)[13-14]。DKK2是調(diào)控Wnt信號(hào)通路的常見(jiàn)分泌型蛋白，其在結(jié)腸癌、腎癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈高度甲基化，扮演抑癌基因的作用[15]。LASS2可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，其低表達(dá)甚至不表達(dá)是惡性腫瘤進(jìn)展的主要原因[16]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組ABCE1、KPNA2、MRPS5、YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于吡柔比星組，DKK2、LASS2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于吡柔比星組(均P<0.05)，說(shuō)明吡柔比星聯(lián)合羥喜樹(shù)堿灌注化療更能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。

惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有賴于一系列侵襲相關(guān)基因的異常表達(dá)，檢測(cè)其具體表達(dá)量也可定量反映癌細(xì)胞的侵襲活力。ILK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的關(guān)鍵成分，可與整合素β1的亞單位結(jié)合并影響多條信號(hào)通路的蛋白表達(dá)[17]。ILK過(guò)表達(dá)可經(jīng)多種途徑抑制癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖、侵襲。NF-κBp65是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在許多惡性腫瘤細(xì)胞中存在持續(xù)激活的NF-κBp65，故特異性抑制其表達(dá)也成為治療惡性腫瘤的新途徑[18]。HMGB1是細(xì)胞核內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)蛋白，具有協(xié)助基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定細(xì)胞核等作用，同時(shí)可促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。有學(xué)者指出，在肝癌、前列腺癌、胃腸道惡性腫瘤中均存在HMGB1的特異性過(guò)表達(dá)，且具體表達(dá)量與癌細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān)[19-20]。PPARγ是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其激動(dòng)劑具有明顯抗腫瘤作用，惡性腫瘤組織中其異常低表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組ILK、NF-κBp65、HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于吡柔比星組，PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量高于吡柔比星組(均P<0.05)，說(shuō)明吡柔比星聯(lián)合羥喜樹(shù)堿灌注化療更能抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。

凋亡是一種程序化死亡過(guò)程，老化或者損傷細(xì)胞的凋亡是維持機(jī)體正常新陳代謝過(guò)程的重要環(huán)節(jié)，損傷細(xì)胞的凋亡受阻是細(xì)胞惡變的起始環(huán)節(jié)，其本質(zhì)是促凋亡基因/抗凋亡基因的表達(dá)失衡。Livin屬于凋亡蛋白抑制因子家族，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)并阻礙癌細(xì)胞的正常凋亡、促使其增殖遷移[22]。Bad是一種促凋亡基因，研究證實(shí)其在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)缺失，且在多種其他惡性腫瘤中呈異常低表達(dá)[23]。Survivin屬于抗凋亡基因，生理狀態(tài)下在成人正常組織中表達(dá)量較低，但在腫瘤惡變后可大量表達(dá)于腫瘤組織中，參與癌細(xì)胞的持續(xù)增殖及凋亡抑制[24]。Caspase-3是幾乎所有細(xì)胞凋亡執(zhí)行的重要分子，受多種基因調(diào)控，其異常低表達(dá)是細(xì)胞凋亡受阻的直接原因[25]。BAG-1具有增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力的作用，細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的BAG-1細(xì)胞株可有效阻止細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組Livin、Survivin、BAG-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于吡柔比星組，Bad、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于吡柔比星組(均P<0.05)，說(shuō)明吡柔比星聯(lián)合羥喜樹(shù)堿灌注化療更能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。

綜上所述，相比于單用吡柔比星膀胱灌注化療，采用吡柔比星聯(lián)合羥喜樹(shù)堿膀胱灌注法治療晚期膀胱癌患者能更有效抑制地癌細(xì)胞的增殖、侵襲活力，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，值得推廣應(yīng)用。