梁軍榮 潘新年 黃維真 梁志坤 張 清 閆 芳 潘慧敏

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院外科，南寧市 530021，電子郵箱：1742644494@qq.com)

肺炎克雷伯菌是新生兒感染最常見(jiàn)的病原菌之一，耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)給新生兒感染的治療、院內(nèi)感染的控制帶來(lái)很大的困難。研究耐藥菌的分子分型對(duì)臨床診斷、控制醫(yī)院感染的暴發(fā)流行具有重要意義。多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技術(shù)是直接檢測(cè)多個(gè)管家基因的核苷酸序列從而發(fā)現(xiàn)細(xì)菌變異的分型方法，多用于種群結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系的研究。因此，本研究采用MLST技術(shù)對(duì)攜帶IMP-4基因的肺炎克雷伯菌進(jìn)行序列分型研究，并采用eBURST軟件進(jìn)行親緣分析，旨在為醫(yī)院感染控制提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2013年6月至2017年6月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院(新陽(yáng)和廂竹院區(qū))、南寧市婦幼保健院住院的新生兒血、痰、肺泡灌洗液、分泌物等樣本，分離獲得的49株耐亞胺培南、美羅培南或厄他培南肺炎克雷伯菌。其中，應(yīng)用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)[最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)法]，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(2016)的標(biāo)準(zhǔn)，厄他培南MIC≥2 μg/mL，或者美羅培南、亞胺培南MIC≥4 μg/mL的肺炎克雷伯菌為耐藥菌株，所需標(biāo)準(zhǔn)菌株(大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603)均由廣西臨床檢驗(yàn)中心提供。剔除同一患兒相同部位的重復(fù)菌株。

1.2 攜帶IMP-4肺炎克雷伯菌的篩選及鑒定 提取49株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌DNA(煮沸法)、PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因、序列測(cè)定(由Inviotrigen公司完成)，經(jīng)與GenBank序列比對(duì)，其中10株檢出IMP基因，均為blaIMP4型；與NCBI Blast數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與IMP-4亞型同源性達(dá)99%。

1.3 主要試劑及儀器 PCR DNA聚合酶購(gòu)于天根生物公司(批號(hào)：S7116)，胰蛋白胨(批號(hào)：2324507)和酵母提取物(批號(hào)：2340951-02)購(gòu)自O(shè)xid公司。Gel DocTMXR電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)的Bio-Rad公司)，TOne 96G梯度PCR儀(美國(guó)Biometra公司)。

1.4 引物合成 參照MLST網(wǎng)站(http://spneumoniae.mlst.net/)提供的引物序列,由Inviotrigen公司合成gapA、infB、 mdh、pgi、phoE、rpoE、tonB 7個(gè)管家基因引物。

1.5 管家基因的PCR檢測(cè) 25 μL反應(yīng)體系：PCR DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，細(xì)菌總DNA 3 μL，雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)步驟：95℃ 5 min；95℃ 40 s；50℃ 40 s；72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后4℃電泳鑒定。

1.6 電泳及PCR產(chǎn)物回收 取PCR產(chǎn)物加樣于溴化乙錠凝膠上，120 V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，然后切膠送Inviotrigen公司測(cè)序。

1.7 序列比對(duì)和MLST數(shù)據(jù)分析 將序列提交到數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bigsdb.web.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public)進(jìn)行在線序列比對(duì)，獲得管家基因等位基因編碼，與gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB成為管家基因譜組合，每個(gè)編碼組合對(duì)應(yīng) 1 個(gè)序列型，與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已有管家基因譜進(jìn)行比對(duì)，得到每株細(xì)菌序列型。

1.8 PCR檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因 參考GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)基因序列信息并合成β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因擴(kuò)增引物，引物由Inviotrigen公司合成。PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟參照管家基因的PCR 擴(kuò)增、測(cè)序。

1.9 eBURST分析 采用eBURST軟件version 3(http://eburst.mlst.net/)對(duì)本研究獲得的等位基因序列進(jìn)行親緣分析。7個(gè)位點(diǎn)中有≥6個(gè)相同歸類(lèi)為1個(gè)分型組,1個(gè)分型組中包含≥3個(gè)序列型的定義為1個(gè)克隆復(fù)合體(clonal complex,CC)。每個(gè)CC中有1個(gè)經(jīng)計(jì)算推測(cè)出的起源序列型,被認(rèn)為是祖先序列型,復(fù)合體中的其他序列型通過(guò)直線與起源序列型相連,直線長(zhǎng)度表示親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

2 結(jié) 果

2.1 MLST結(jié)果 經(jīng)與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌可分成6個(gè)序列型，其中以序列型20為主(4株)，占40%,分布在兩家醫(yī)院，其次為序列型1473，占20%。所有菌株均檢測(cè)到耐藥基因SHV-11及TEM-1。見(jiàn)表1。

表1 10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌的序列型及耐藥基因

注：A為廣西區(qū)婦幼保健院(廂竹院區(qū))，B為廣西區(qū)婦幼保健院(新陽(yáng)院區(qū))，C為南寧市婦幼保健院。

2.2 eBURST分析結(jié)果 10株菌株有1個(gè)主要CC(CC11)，包含序列型20、序列型37、序列型234，涉及6株菌株(占60%)，屬于祖先型為序列型11的復(fù)合體，其他均可認(rèn)為是單獨(dú)的序列型，而不屬于任何一個(gè)CC，見(jiàn)表2。

表2 10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌的eBURST分析結(jié)果

注：FREQ為菌株出現(xiàn)頻率，SLV 為單位點(diǎn)突變， DLV為雙位點(diǎn)突變，TLV為三位點(diǎn)突變，SAT為衛(wèi)星型。

3 討 論

近年來(lái)，在新生兒中出現(xiàn)耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌，但有關(guān)新生兒耐藥基因的研究報(bào)道較少。本研究在新生兒中收集到的耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌主要是產(chǎn)B類(lèi)碳青霉烯酶，IMP-4是其主要基因型[1-2]。其編碼基因同時(shí)攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因SHV-11、TEM-1，由于常與其他耐藥基因共存，可引起對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、單酰胺類(lèi)等抗生素的多重耐藥。

MLST分析結(jié)果顯示，10株攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌分為6個(gè)不同序列型，其中以序列型20為主，其次是序列型1473；同一基因型可存在于不同的醫(yī)院，同一醫(yī)院存在不同基因型，即序列型別分布散在，型別未呈現(xiàn)集中的趨勢(shì)，提示上述菌株的遺傳背景具有多樣性。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌的MLST分析研究極少，所報(bào)告的序列型別也有所不同，在澳大利亞其型別為序列型1727、序列型1728、序列型1729[3]，在中國(guó)香港為序列型1306、序列型889[4]，在中國(guó)大陸有序列型105、序列型1876、序列型147[5-6],未見(jiàn)有關(guān)主要型別及流行型別的研究報(bào)道。目前，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)攜帶IMP-4型的序列型20肺炎克雷伯菌的研究報(bào)道，但有報(bào)道顯示，在山東省一家新生兒病房序列型20見(jiàn)于NDM-1型的耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌[7]，而在希臘其見(jiàn)于攜帶SHV-5型的肺炎克雷伯菌[8]，兩者的共同特點(diǎn)是序列型20肺炎克雷伯菌可引起新生兒感染的暴發(fā)。本研究納入兩家醫(yī)院的新生兒中， 序列型20是攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌最主要的克隆株，據(jù)此推測(cè)序列型20易捕獲攜帶B類(lèi)碳青霉烯酶基因的耐藥質(zhì)粒,引起新生兒感染。同時(shí)，eBURST分析結(jié)果顯示，序列型20、序列型37、序列型234同屬一個(gè)主要CC，序列型11為其祖先型。序列型11是我國(guó)攜帶kpc-2的肺炎克雷伯菌的主要克隆型[9]，序列型20與序列型11有較近的親緣關(guān)系，Institut Pasteur MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bigsdb.web.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public)顯示序列型11與序列型20之間只存在3個(gè)管家基因(rpoB、phoE、infB)的差異。

此外，本研究中，4株序列型20分別來(lái)自?xún)杉裔t(yī)院，分離時(shí)間集中在2013年，其中1株分離時(shí)間是2013年12月，其余3株來(lái)自同一家醫(yī)院，分離時(shí)間在2013年7月，表明攜帶IMP-4的肺炎克雷伯菌在本地區(qū)同一家醫(yī)院具有較高聚集性，可能存在序列型20肺炎克雷伯菌院內(nèi)感染的發(fā)生；且4株序列型20均攜帶IMP-4、SHV-11、TEM-1基因，具有相同的基因特征。這提示攜帶IMP-4 的序列型20肺炎克雷伯菌感染在本地區(qū)同一家醫(yī)院曾出現(xiàn)暴發(fā)。

總之，序列型20是這兩家醫(yī)院新生兒產(chǎn)IMP-4肺炎克雷伯菌的主要流行克隆群，且序列型20在其中一家醫(yī)院中曾發(fā)生醫(yī)院感染暴發(fā)，應(yīng)引起醫(yī)院相關(guān)部門(mén)和醫(yī)務(wù)人員的高度重視。