郭 輝 魏斐斐 蔣群湘 謝裕安

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部，南寧市 530021，電子郵箱：guohui6222@163.com；2 廣西桂林市人民醫(yī)院放療科，桂林市 541002；3 廣西柳州市人民醫(yī)院放療科，柳州市 545006)

在我國，原發(fā)性肝細(xì)胞癌(下稱“肝癌”)的發(fā)病率和死亡率分別高居惡性腫瘤的第四位和第二位[1]，極大威脅著居民的生命健康。廣西扶綏縣是我國肝癌高發(fā)地區(qū)之一，具有明顯的家族聚集性[2]。肝癌的發(fā)生發(fā)展在很大程度上與個體間基因型的遺傳多態(tài)性密切相關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代遺傳標(biāo)記，有助于解釋不同群體或個體對腫瘤易感性的差異[3]。甘露聚糖結(jié)合凝集素關(guān)聯(lián)絲氨酸蛋白酶(mannan-binding lectin-associated serine protease,MASP)1基因位于染色體3q27-3q28，含有18個外顯子，其可通過前mRNA剪切編碼3種蛋白質(zhì)，即MASP1、MASP3、甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)蛋白44(mannan-binding lectin-associated protein 44,MAp44)[4]。其中，MASP1是補體激活途徑的重要組成部分，可影響機體免疫反應(yīng)，與多種疾病的發(fā)生顯著相關(guān)[5]。因此，本研究以MASP1基因rs3774268和rs17040位點作為研究靶點，利用質(zhì)譜技術(shù)對廣西扶綏縣壯族肝癌家系及正常家系的基因位點進行檢測，探討MASP1基因多態(tài)性與肝癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 在廣西扶綏縣采集20個肝癌高發(fā)家系，由20例肝癌患者(肝癌組)，以及59例與患者有血緣關(guān)系的直系健康親屬(非肝癌組)組成。納入標(biāo)準(zhǔn)：肝癌高發(fā)家系成員均為廣西扶綏縣常住(全年在家居住6個月以上)壯族人群(三代以內(nèi)均為壯族人群)；肝癌高發(fā)家系非肝癌組為與肝癌患者有直接血緣關(guān)系且未患肝癌的一級親屬(包括父母、子女、兄弟姐妹)和二級親屬(包括叔伯、堂兄弟姐妹)。肝癌組患者于2003年1月至2011年11月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受外科治療，術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)確診為肝癌，且術(shù)前未行化療、放療或生物治療等；男17例,女3例；年齡28～65歲,中位年齡45歲；HbsAg(+)19例,HbsAg(-)1例；甲胎蛋白(+)13例,甲胎蛋白(-)7例；吸煙5例,不吸煙15例；飲酒2例,不飲酒18例。非肝癌組中，男28例,女31例；年齡16～86歲,中位年齡42歲； HbsAg(+)31例,HbsAg(-)28例；甲胎蛋白(+)1例,甲胎蛋白(-)58例；吸煙12例,不吸煙47例；飲酒12例,不飲酒47例。選擇與肝癌高發(fā)家系無血緣關(guān)系的40例扶綏縣居民為正常對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：與肝癌高發(fā)家系無血緣關(guān)系的扶綏縣人群(三代以內(nèi)居住在扶綏縣)，且無肝炎病史、腫瘤病史及遺傳病史。正常對照組中，男26例,女14例；年齡16～85歲,中位年齡47歲；吸煙15例,不吸煙25例；飲酒17例,不飲酒23例。3組間性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究根據(jù)國家人類基因組研究倫理準(zhǔn)則進行，所有選定者均簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 相關(guān)定義 (1)吸煙：近期或以往吸卷煙100支或煙絲100 g以上；(2)飲酒：近期或以往每周飲酒至少1次,每次折合純酒精量>40 g,連續(xù)飲半年以上。

1.3 MASP1基因型分析

1.3.1 主要試劑及儀器：血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京天根生物公司。Gold Reagent Kit試劑盒、MassARRAY Assay Designer 3.1軟件、MassARRAY Samsung Nanodispenser RS 1 000 nL點樣儀、MassARRAY Analyzer Compact質(zhì)譜系統(tǒng)均購自美國Sequenom公司。質(zhì)譜儀微陣列芯片SpectroChip、熱啟動Taq酶均購自美國Agena Bioscience公司。

1.3.2 DNA提取：采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取肝癌組癌組織樣本、非肝癌組及正常對照組靜脈血液(無須空腹)樣本的DNA。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，提取后用分光光度計測定DNA的純度(A值為1.7～2.1)，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設(shè)計與合成：采用MassARRAY Assay Designer 3.1軟件設(shè)計引物，各SNP位點均需要一條延伸引物和兩條PCR擴增引物，引物序列見表1。PCR擴增引物、單堿基延伸引物由深圳華大基因公司合成。

表1 引物序列

1.3.4 PCR擴增、引物延伸及芯片點樣：使用熱啟動Taq酶和引物常規(guī)擴增靶片段(40個循環(huán))。在上述PCR產(chǎn)物中加入2 μL堿性酸化酶消化，以除去多余的脫氧核糖核苷三磷酸，消化程序：37℃ 60 min；85℃ 10 min。然后根據(jù)延伸反應(yīng)程序執(zhí)行單堿基延伸，并通過樹脂脫鹽純化產(chǎn)物。最后使用點樣儀將純化后的產(chǎn)物在質(zhì)譜儀微陣列芯片SpectroChip上點樣。

1.3.5 檢測SNP位點：使用Mass ARRAY Analyzer Compact質(zhì)譜系統(tǒng)實驗平臺對MASP1基因進行SNP分型，將已點好樣的SpectroChip放入質(zhì)譜儀進行自動化檢測。檢測完成后用TYPER 4.0軟件分析實驗結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。通過引物延伸反應(yīng)獲得的產(chǎn)物質(zhì)譜峰的位置確定其分子質(zhì)量以獲得分型結(jié)果。在質(zhì)譜圖上，1種顏色可以對應(yīng)2個或3個峰值，為SNP位點的延伸引物峰及兩個等位基因峰，若該位點屬于純合子，則僅存在1個等位基因峰,若為雜合子，則存在2個等位基因峰。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗對各組基因型進行Hardy-Weinberg平衡檢驗[6]。采用非條件Logistic回歸分析計算各基因型和等位基因人群患肝癌風(fēng)險的比值比(odds ratio,OR)及95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，校正因素為年齡、性別、吸煙、飲酒、HBsAg、甲胎蛋白。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因型檢測結(jié)果 MASP1基因rs3774268位點存在AA、GG和GA 3種基因型，其中AA基因型6例、GG基因型79例、GA基因型34例。rs17040位點存在CC、CT兩種基因型，其中CC基因型101例、CT基因型17例，非肝癌組中有1例未能檢測出rs17040位點的基因型。MASP1基因質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 MASP1基因rs3774268位點和rs17040位點質(zhì)譜圖

注：圖A、B、C分別是rs3774268位點GG、AA、GA基因型的質(zhì)譜圖；圖D、E分別是rs17040位點CC、CT基因型的質(zhì)譜圖。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 結(jié)果顯示,MASP1基因rs3774268和rs17040位點各基因型頻率與期望值吻合度較好(均P>0.05),各組具有人群代表性。見表2。

表2 MASP1基因rs3774268和rs17040位點基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果[n(%)]

2.3 MASP1基因rs3774268和rs17040位點多態(tài)性與肝癌易感性的關(guān)系 肝癌組與非肝癌組rs3774268和rs17040位點各基因型和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。肝癌組與正常對照組rs3774268位點的基因型頻率、rs17040位點各基因型和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；而肝癌組rs3774268位點的A等位基因頻率高于正常對照組(P<0.05)。Logistic回歸分析顯示，經(jīng)年齡、性別、吸煙、飲酒、HBsAg、甲胎蛋白校對后，rs3774268位點的A等位基因與肝癌的發(fā)生相關(guān)(P<0.05)。見表3及表4。

表3 MASPI基因rs3774268位點多態(tài)性與肝癌家系遺傳易感性的關(guān)系

表4 MASPI基因rs17040位點多態(tài)性與肝癌家系遺傳易感性的關(guān)系

3 討 論

補體系統(tǒng)是人體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,可通過一系列絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)酶解反應(yīng)活化,其活化中間產(chǎn)物最終形成的攻膜復(fù)合物可發(fā)揮調(diào)節(jié)吞噬、化學(xué)趨化、介導(dǎo)細(xì)胞溶解、清除免疫復(fù)合物及細(xì)胞凋亡等功能[7]。人體可通過3種途徑(經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)激活補體系統(tǒng)。MASP1是補體激活途徑的重要組成部分，可影響機體免疫反應(yīng)，與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[4]。MASP1基因可通過前mRNA剪切編碼三種蛋白質(zhì)-MASP1、MASP3、MAp44。MASP1蛋白是由699個氨基酸殘基和19個氨基酸殘基構(gòu)成的前導(dǎo)肽，是一種通過快速自激活然后分裂MASP2來觸發(fā)凝集素途徑的酶[8]；MASP3蛋白由728個氨基酸殘基(包括19個氨基酸殘基)組成，可通過與MASP1或MASP2競爭結(jié)合凝集素途徑的模式識別分子來負(fù)調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)，同時其還具有活化D因子的活性，而D因子是補體旁路途徑活化的關(guān)鍵酶[9]； MAp44也可通過與MASP1、MASP2、MASP3競爭結(jié)合凝集素途徑的模式識別分子來負(fù)調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)[10]。研究表明MASP1基因rs3774275位點的多態(tài)性與肺結(jié)核的發(fā)生有顯著的相關(guān)性[11]；MASP1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[12]、原發(fā)性平滑肌肉瘤[13]中呈高表達(dá)，且血清高MASP1水平與宮頸癌進展和較差的疾病預(yù)后明顯相關(guān)[14]。但目前未見MASP1基因多態(tài)性與肝癌關(guān)系的相關(guān)文獻報道，因此，本研究分析了MASP1基因不同位點SNP與肝癌易感性的關(guān)系，以期能夠找到篩選肝癌高危人群的靶點，并為闡明肝癌發(fā)生的分子機制和預(yù)防提供實驗室依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，在正常人群中，rs3774268位點A等位基因個體罹患肝癌的風(fēng)險是G等位基因個體的3.75倍(P<0.05)，但rs17040位點不同基因型及等位基因個體間罹患肝癌的風(fēng)險比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。這提示MASP1基因rs3774268位點攜帶A等位基因者肝癌發(fā)生風(fēng)險較高，而rs17040位點的SNP與肝癌高發(fā)家系遺傳易感性間無明顯相關(guān)性。

綜上所述，MASP1基因rs3774268位點的SNP與廣西扶綏縣壯族人群肝癌高發(fā)家系遺傳易感性存在關(guān)聯(lián)，而rs17040位點的SNP與廣西扶綏縣壯族人群肝癌高發(fā)家系遺傳易感性無關(guān)聯(lián)。由于本研究僅在廣西扶綏的壯族人群中進行，且樣本量較小，可能存在一定的選擇偏倚，之后需擴大樣本含量，并在不同地區(qū)和不同人群中進行更深入的研究。