李 靖 袁乙平 - 劉 婷U 岳文婷 -何雨婕 - 馬 嫄 an 蔣珍菊 -

(1. 西華大學(xué)，四川 成都 610039； 2. 四川環(huán)太生物科技股份有限公司,四川 成都 610207)

由于實際生產(chǎn)條件的限制，豬在宰殺后無法立即送入工廠進(jìn)行加工，必須先在冷庫中進(jìn)行冷凍儲存。然而豬肉在凍結(jié)、凍藏過程中由于水的“相變”及遷移引起蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)發(fā)生一系列的變化，會對冷凍豬肉的品質(zhì)產(chǎn)生不同程度的影響。近年來，關(guān)于冷凍豬肉的研究報道很多[1-2]，而關(guān)于豬肉在凍結(jié)、凍藏過程中水分的動態(tài)變化以及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究較少。迄今，絕大多數(shù)相關(guān)研究集中于豬肉在冷凍、解凍過程中常規(guī)理化性質(zhì)(如蛋白質(zhì)的氧化、脂肪的氧化、pH值等)、感官品質(zhì)發(fā)生的變化[3-4]，然而豬肉在不同凍藏時間過程中水分的動態(tài)變化與品質(zhì)變化之間的相關(guān)性研究相對薄弱。

低場核磁共振(Low Field Nuclear Magnetic Resonance，LF-NMR)技術(shù)是一種無損檢測技術(shù)，目前已應(yīng)用于食品水分分析。LF-NMR的T2弛豫參數(shù)能夠精確反映肉在凍結(jié)過程中水分的“態(tài)變”和遷移[5]。低場核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)技術(shù)是通過對放入磁場中的樣品進(jìn)行H+的磁共振信號采集，經(jīng)過信號處理后獲得樣品的H+密度圖像，從而實現(xiàn)對樣品的成像[6]。一維頻率編碼和梯度磁場作為核磁共振成像技術(shù)的關(guān)鍵，如圖1所示，在選定層面的X方向上添加一線性變化的梯度場G(x，y，z)，使得沿X軸方向質(zhì)子所處的磁場發(fā)生線性變化，使得磁場中不同坐標(biāo)處的質(zhì)子將以與其坐標(biāo)位置相對應(yīng)的頻率亦產(chǎn)生線性變化，從而利用梯度磁場實現(xiàn)對不同空間位置共振信號的頻率編碼，將采集到的信號通過傅立葉變換后即可得到信號頻率與X方向位置的線性一一對應(yīng)的信號[7]。利用LF-NMR、MRI及一維頻率編碼技術(shù)可以準(zhǔn)確地反映豬肉在不同凍藏時間過程中水分的動態(tài)變化。

豬背最長肌作為骨骼肌的一種，其肌纖維在豬的生長發(fā)育過程中呈明顯的發(fā)育性變化規(guī)律[8]，且加工中多用作主要原料進(jìn)行生產(chǎn)。本試驗擬以豬背最長肌為研究對象，利用LF-NMR技術(shù)對凍藏不同時間的豬背最長肌進(jìn)行水分分析：利用T2弛豫分析各組分水分含量的變化，然后采用核磁共振成像技術(shù)結(jié)合一維空間頻率編碼技術(shù)對不同凍藏期內(nèi)肉樣水分分布變化進(jìn)行圖像分析，觀察凍藏時間對肉樣中水分各組分含量和分布位置的影響。同時對凍藏不同時間的豬背最長肌進(jìn)行品質(zhì)指標(biāo)的測定，將品質(zhì)指標(biāo)和水分變化進(jìn)行相關(guān)性分析，觀察各指標(biāo)在凍藏時間上的相關(guān)性及相互影響機(jī)制，分析水分變化與肉品品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性，通過橫向弛豫時間T2和峰面積變化從而實現(xiàn)對豬肉凍藏過程中品質(zhì)變化監(jiān)測。

圖1 一維方向梯度磁場

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌：大約克夏豬，月齡10個月，宰殺前重量約100 kg，購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；

氧化鎂、三氯乙酸、氯仿、EDTA、TBA、碘化鉀、磷酸鹽、硫酸銅、氫氧化鈉等：分析純，成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低場核磁共振儀：MesoMR23-040V-1型，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；

自動凱氏定氮儀：K9840型，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；

酶標(biāo)儀：Molecular Devices SpectraMax i3x型，美谷分子儀器(上海)有限公司；

水浴鍋：DK-98-Ⅱ型，天津市泰斯特儀器有限公司；

離心機(jī)：TD-5M型，四川蜀科儀器有限公司；

冰箱：BCD-649WE型，青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗方法

將鮮肉剔除筋腱、脂肪組織后，切分為100 g左右，將分割好的肉樣平鋪于保鮮膜上，包好，置于-18 ℃ 凍藏，凍藏時間分別為0 d和1，3，6，9，12，15個月。

1.4 分析測定方法

1.4.1 解凍汁液流失率的測定 解凍前對肉樣稱重M1，按Honikel[9]方法將冷凍肉樣吊掛，于4 ℃解凍24 h，收集解凍汁液，而后利用濾紙將肉樣表面水分擦拭干凈，記錄肉樣解凍后重量M2，而后按式(1)計算肉樣解凍汁液流失率。

(1)

式中：

DL——解凍汁液流失率，%；

M1——解凍前對肉樣重量，g；

M2——解凍后肉樣重量，g。

1.4.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照GB 5009.228—2016的方法，運(yùn)用自動凱氏定氮儀法進(jìn)行測定。

1.4.3 蛋白質(zhì)溶解度的測定

(1) 樣品的測定：取1 g樣品切碎，加入20 mL pH 7.2 的碘化鉀(1.1 mol/L)和磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)的混合液，振蕩攪拌30 min，于4 ℃保存20 h，2 600×g離心30 min，取上清液1 mL，再加入雙縮脲試劑A(0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液)3 mL，振蕩均勻后加入雙縮脲試劑B(0.01 g/mL 的硫酸銅溶液)2滴，振蕩5 min后于37 ℃水浴20 min，于540 nm處測吸光值[10]。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：利用牛血清蛋白作對照，分別取濃度為2 mg/mL的牛血清蛋白0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL(牛血清蛋白質(zhì)量為0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mg)。向每只試管中加入蒸餾水至1 mL，加入雙縮脲試劑量和操作方法同上。以牛血清蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.036 4x-0.000 2，R2=0.999 6，其中y為吸光度，x為蛋白質(zhì)溶解度(mg/g)。

1.4.4 硫代巴比妥酸值(TBARS)的測定 參照Marianne等[11]的方法，與TBA反應(yīng)的物質(zhì)的量(TBARS)，測量結(jié)果以每100 g肉中丙二醛的毫克數(shù)來表示。

TBARS=(A532-A600)/155×(1/10)×72.6×100，

(2)

式中：

TBARS——硫代巴比妥酸值，mg/100 g；

A532——532 nm處所測的紫外吸光光度值；

A600——600 nm處所測的紫外吸光光度值。

1.4.5 水分的測定

(1) LF-NMR測定自旋—晶格弛豫時間(T2)：將豬背最長肌于4 ℃解凍24 h后，切分成2 cm×2 cm×1 cm大小，用濾紙擦拭干凈樣品表面水分，置于核磁樣品管中，而后放入磁體腔內(nèi)，進(jìn)行核磁共振測定樣品中水分含量[12]。首先在Q-FID序列下進(jìn)行儀器的校正，放入樣品，尋找樣品最佳的等待時間和重復(fù)次數(shù)參數(shù)值，最后選擇Q-CPMG序列進(jìn)行樣品的弛豫數(shù)據(jù)采集。測試條件：氫質(zhì)子共振頻率23 MHz，測定溫度32 ℃，采樣頻率100 kHz，回波數(shù)1 500，回波時間1.00 ms，重復(fù)次數(shù)2，等待時間3 500 ms，NMR測得的圖為自由誘導(dǎo)指數(shù)衰減曲線，通過儀器自帶的反演軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)反演，得到樣品中不同組分水分的弛豫時間與峰面積。

(2) MRI進(jìn)行樣品成像處理：首先進(jìn)行儀器的采樣前校正，后將樣品置于核磁樣品管內(nèi)，放入磁體腔內(nèi)，利用MRI軟件進(jìn)行樣品的水分分布成像，最后使用儀器自帶的圖像處理軟件進(jìn)行圖片的處理[13]。成像數(shù)據(jù)先統(tǒng)一灰度映射處理并導(dǎo)出，利用偽彩進(jìn)行圖像的深度處理，使其能夠更加直觀反映樣品的水分分布。

測定參數(shù)：重復(fù)時間(TR)1 000.00 ms，回波時間(TE)18.125 ms，成像方位為俯視圖。

(3) 樣品的一維頻率編碼分析：進(jìn)入弛豫時間分析軟件，首先放入水膜標(biāo)樣對儀器進(jìn)行校正，得到O1，而后將樣品放入核磁樣品管中，置于磁體腔內(nèi)，進(jìn)行樣品的一維頻率編碼數(shù)據(jù)采集，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Gr-SL-QY軟件中，進(jìn)行數(shù)據(jù)的解析。

1.5 數(shù)據(jù)分析與作圖

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0處理并進(jìn)行Dunacans差異顯著性分析和Pearson相關(guān)性分析，用Origin 8.6進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)指標(biāo)分析

2.1.1 解凍汁液流失率 如圖2所示，對照組(凍藏0 d)的樣品解凍汁液流失率最低，為4.81%，當(dāng)凍藏時間達(dá)到15個月后達(dá)到22.5%。肉在凍結(jié)過程中，由于蛋白質(zhì)的不斷氧化，細(xì)胞內(nèi)鹽濃度的增加導(dǎo)致肌原纖維蛋白疏水性區(qū)域內(nèi)的氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)杷詺埢┞冻鰜?，同時冰晶體不斷長大，破壞肌原纖維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水分子之間的氫鍵作用、疏水結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[14-15]，因此降低了肌原纖維纖絲間保持水分的毛細(xì)管的力從而導(dǎo)致肌肉持水力降低，同時其他大分子物質(zhì)的氧化也會改變水分與大分子物質(zhì)之間的作用力。因此在解凍過程中水分受到的束縛力降低，容易從肉中浸出使得解凍汁液的流失率增加[16]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.2 揮發(fā)性鹽基氮 TVB-N是蛋白質(zhì)在貯藏過程中微生物等作用分解產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氨物質(zhì)，其與肉的新鮮度直接相關(guān)[4]。由圖3可得，凍藏時間越長，肉樣中的TVB-N含量越高。凍藏前3個月內(nèi)，其TVB-N含量最高為13.71 mg/100 g，當(dāng)凍藏6個月時肉樣的TVB-N含量為15.93 mg/100 g，根據(jù)GB 2707—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》規(guī)定，一級鮮肉TVB-N含量≤15 mg/100 g。而本試驗凍藏15個月時TVB-N含量嚴(yán)重超標(biāo)(27.72 mg/100 g)，此時肉已無法食用。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 蛋白質(zhì)溶解度 從圖4可知，隨著凍藏時間的延長，蛋白質(zhì)溶解度下降，前3個月蛋白質(zhì)溶解度下降緩慢，維持在200 mg/g水平；3個月后下降速度增大，凍藏15個月時蛋白質(zhì)溶解度已下降到65.27 mg/g，僅為初始值的1/4左右，差異極顯著(P<0.01)。蛋白質(zhì)溶解度是評價肌肉蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標(biāo)，凍藏時間越長，冰晶體長大、鹽濃度增加、蛋白質(zhì)氧化等因素會引起蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)溶解度的降低是肌肉品質(zhì)下降的重要指標(biāo)，因為肌肉蛋白質(zhì)的功能特性只有在蛋白質(zhì)處于高溶解狀態(tài)下才能表現(xiàn)出來[17]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.1.4 TBARS值 從圖5可知，肉樣的TBARS值隨凍藏時間的延長而增長，凍藏15個月時達(dá)到了最大值為0.445 mg/100 g。在貯藏過程中受微生物、氧氣、酶等因素的影響會促進(jìn)不飽和脂肪酸氧化酸敗，產(chǎn)物為醛類，可與TBA(硫代巴比妥酸)生成丙二醛；因此隨著貯藏時間的延長，豬肉的氧化程度不斷加深，得到的TBARS值也就相應(yīng)增大。脂肪的氧化酸敗會產(chǎn)生哈味，嚴(yán)重影響肉品的感官品質(zhì)[18]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 水分分析

圖6為豬背最長肌在不同凍藏水分隨時間變化的弛豫圖譜，從圖6可以看出，T20隨著時間的延長弛豫時間變化不明顯，T21峰面積不斷減小，T22峰面積不斷變大，且弛豫時間變短。由表1可知，在整個凍藏期內(nèi)，T20弛豫時間和峰面積變化不顯著。T21弛豫時間和峰面積隨著凍藏時間的延長呈逐漸降低的趨勢，凍藏15個月后肉樣不易流動水的含量顯著降低。在凍藏初期，由于肌纖維的收縮作用，大分子物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與水分子之間的結(jié)合更加緊密，造成弛豫時間降低，但是隨著凍藏時間的延長，大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞程度增大，其基團(tuán)發(fā)生改變，使得水分與大分子之間的作用力減弱，解凍后體系中留存水分的弛豫時間逐漸縮短[19-20]。凍結(jié)豬肉在解凍過程中內(nèi)部形成的冰晶對肌原纖維結(jié)構(gòu)造成擠壓，導(dǎo)致部分不易流動水流出，存留在其中的不易流動水更加穩(wěn)定，表現(xiàn)為出峰時間前移。豬肉在凍藏12個月后，肌纖維完整性被破壞，肉在解凍后變得顏色灰白、組織柔軟、無彈性，且氨基酸、蛋白等營養(yǎng)成分流失嚴(yán)重，肌原纖維蛋白疏水性氨基酸殘基不斷向外暴露，導(dǎo)致疏水性指數(shù)和巰基含量不斷增加，解凍后部分不易流動水流出，造成不易流動水的峰面積和峰比例顯著下降。

圖6 不同凍藏時間豬背最長肌的三維T2弛豫時間圖譜

Figure 6 Three-dimensionalT2relaxation time plot of longissimus dorsi muscle with different frozen storage time

表1 不同凍藏時間豬背最長肌中3種狀態(tài)水分的弛豫時間及峰面積變化

? 同一列中字母不同代表顯著不同(P<0.05)，P20、P21、P22分別代表T20、T21、T22的峰面積。

T22值隨著凍藏時間的延長，呈逐漸降低的趨勢，而水分含量則呈逐漸增加的趨勢，凍藏15個月以后，自由水的峰面積比為35%，可能是隨著凍藏時間的延長，肉中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞以及溶解度的降低，影響了整體的結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)和水分之間的結(jié)合狀態(tài)，導(dǎo)致自由水的弛豫時間降低，同時其峰形與不易流動水之間發(fā)生重疊[21-22]。在整個凍藏考察期內(nèi)，T21與T22的變化最為顯著，豬肉中不易流動水比例下降，自由水比例上升。龐之列等[16]發(fā)現(xiàn)冷凍豬肉解凍后的低場核磁共振弛豫時間T2中的第2個峰(P21)的峰面積減小。

2.3 MRI分析

通過對不同凍藏時間的豬背最長肌進(jìn)行H+質(zhì)子密度成像，結(jié)果見圖7。由圖7可知，在凍藏初期，水分的分布較均勻，凍藏3個月后肉樣邊緣部位的亮度增加，越靠近樣品中間，亮度越低，說明水分逐漸由中間部位向邊緣部位遷移；凍藏9個月后，水分又逐漸恢復(fù)均勻分布的狀態(tài)；15個月后肉樣中的水分分布恢復(fù)較均勻狀態(tài)。可能是凍藏過程中，冰晶體長大、鹽濃度增加、蛋白質(zhì)及脂肪氧化等因素的作用，體系對水分的束縛力降低；在解凍的過程中水分從肌肉內(nèi)部逐漸向外遷移，導(dǎo)致邊緣部分信號量增加。但當(dāng)凍藏時間持續(xù)增加時，肌肉的組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，肌纖維出現(xiàn)彎曲、斷裂，細(xì)胞破裂，肉樣在解凍后由于體系的束縛作用減弱，水分逐漸呈均勻分布狀態(tài)[23]。

亮度越高表示水分含量越高

Figure 7 MRI plot of longissimus dorsi muscle with different frozen storage time

2.4 一維空間頻率編碼分析

對樣品進(jìn)行一維頻率編碼掃描，如圖8所示，隨著凍藏時間的延長，肉中水分的信號量(幅值)逐漸降低，鮮肉的水分幅值在5×104左右，當(dāng)凍藏15個月后，水分的信號量降低了50%以上，僅為2×104左右。通過單一的MRI技術(shù)，能夠直觀對樣品中不同部位的水分分布信息進(jìn)行成像，同時結(jié)合一維頻率編碼手段，能夠更加直觀地反映不同處理情況下肉樣中的水分情況。通過對肉樣進(jìn)行MRI成像，同時結(jié)合一維頻率編碼技術(shù)可對不同處理情況下肉樣中水分的分布情況、流失情況進(jìn)行更加深入、直觀地分析。

Figure 8 LF-NMR one-dimensional frequency coding plot of longissimus dorsi with different frozen storage time

2.5 各指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表2可知，對水分來說，T21與凍藏時間、TVB-N、TBARS、解凍損失、蛋白質(zhì)溶解度之間顯著相關(guān)(P<0.05)。T22與凍藏時間、TVB-N之間顯著相關(guān)(P<0.01)，與TBARS、解凍損失、蛋白質(zhì)溶解度之間呈顯著性相關(guān)(P<0.05)。P21、P22則與TVB-N、TBARS、解凍損失之間呈顯著性相關(guān)，T21、T22與肉中品質(zhì)指標(biāo)呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。冷凍豬肉水分的變化會引起品質(zhì)指標(biāo)之間的變化，因此可利用T21、T22兩指標(biāo)進(jìn)行不同凍藏時間下肉品質(zhì)的評定。T21、T22、P21、P22與解凍損失之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，解凍損失率與肉的大部分典型指標(biāo)都呈現(xiàn)出較高的相關(guān)性，隨著解凍損失的增加，肉中的水分流失加劇，而不易流動水和自由水由于與體系結(jié)合程度依次降低，體系的束縛作用減弱，因此與水分指標(biāo)之間呈現(xiàn)出較高的相關(guān)性，同時肌肉中的蛋白質(zhì)、脂類、多肽、氨基酸等隨著水分的流失而流失，各種酶類在肌纖維間重新分布，因此呈現(xiàn)出較高的相關(guān)性。T2弛豫的參數(shù)與冷凍肉中冰晶體造成的肌纖維損傷之間有著緊密的聯(lián)系[24]，凍結(jié)過程中冰晶的形成對豬肉機(jī)械組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的破壞，同時水分凍結(jié)造成鹽濃度升高，使得體系中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，最終影響肉的感官品質(zhì)和加工特性。

表2 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析?

? **表示在P<0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，*表示P<0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗主要研究了不同凍藏時間豬背最長肌中水分的分布及含量變化情況，以及凍藏過程中肉樣中蛋白質(zhì)溶解度、TVB-N、TBARS、汁液流失率的變化。研究表明：隨著凍藏時間的延長，肉樣中T20變化很小，T21組分降低，T22組分增加。MRI表明在凍藏初期，水分的分布較均勻，隨著凍藏時間的延長，水分向邊緣擴(kuò)散，隨著凍藏時間的繼續(xù)延長，水分又逐漸恢復(fù)較均勻分布的狀態(tài)。一維頻率編碼掃描發(fā)現(xiàn)隨著凍藏時間的延長，肉中水分的信號量(幅值)逐漸降低。各指標(biāo)間的相關(guān)性分析表明：T21、T22與各品質(zhì)指標(biāo)間都有顯著相關(guān)性。因此，可以用LF-NMR、MRI和一維頻率編碼技術(shù)檢測不同凍藏時間下肉中水分的分布情況，分析水分變化與肉品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性，通過橫向弛豫時間T2和峰面積變化可實現(xiàn)對豬肉凍藏過程中品質(zhì)變化監(jiān)測。

本次試驗過程中沒有測定自旋—晶格弛豫時間T1的變化、不同凍藏時間豬背最長肌中水分變化對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，后續(xù)可深入研究水分變化對冷凍豬肉脂肪氧化、蛋白質(zhì)氧化以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。