徐念薇 - 黃軼群 - 賴克強(qiáng) -

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114)

亞胺硫磷是一種有機(jī)磷農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于棉花、水稻、果蔬等作物的病蟲害防治，過多使用會對環(huán)境和人體造成危害[1]。相較于高效液相色譜法[2]、氣相色譜法[3-4]、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜[5-7]、酶聯(lián)免疫法[8-9]等，表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced Raman scattering，SERS)技術(shù)對樣品前處理及儀器操作的要求簡單，且對痕量物質(zhì)檢測的靈敏度高，具有良好的農(nóng)藥殘留檢測應(yīng)用前景[10-15]。SERS增強(qiáng)效果與納米基底的材質(zhì)、結(jié)構(gòu)、形狀、尺寸等因素有關(guān)[16-17]。金和銀納米粒子(nanoparticles，NPs)是常用的SERS基底，但在SERS增強(qiáng)效果和穩(wěn)定性等方面各有利弊[18-19]，金核銀殼納米粒子(Au-Ag NPs)兼具金納米粒子穩(wěn)定性好和銀納米粒子增強(qiáng)效應(yīng)高的優(yōu)良性能，且形狀結(jié)構(gòu)可調(diào)控，是一種較為理想的SERS基底，具有良好的應(yīng)用前景[20-21]。

由于SERS技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域呈現(xiàn)巨大的潛力，近年來關(guān)于亞胺硫磷殘留的SERS檢測已有相關(guān)報(bào)道。如劉江美等[22]將亞胺硫磷吸附于銀溶膠表面，建立了濃度與特征峰高強(qiáng)度的線性回歸方程，結(jié)果表明峰強(qiáng)度與亞胺硫磷濃度在5.0×10-7～1.2×10-5mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。汪宣等[23]基于金納米顆粒修飾的粉末狀聚甲基丙烯酸縮水甘油酯—二甲基丙烯酸乙二酯材料對橙子表面的亞胺硫磷進(jìn)行檢測，能夠檢測到8.25 μg/kg 的SERS信號。Luo等[24]使用金納米溶膠快速檢測蘋果提取液中的亞胺硫磷，最低檢出濃度為1 μg/g。上述研究對象多為標(biāo)準(zhǔn)溶液或水果提取液，關(guān)于Au-Ag NPs作為增強(qiáng)基底直接檢測實(shí)際樣品中的亞胺硫磷殘留未有報(bào)道。本研究擬通過改變Au-Ag NPs 金核大小及銀層厚度，探究不同粒徑和金銀比例對亞胺硫磷SERS檢測效果的影響，以及Au-Ag NPs用于快速檢測未經(jīng)樣品預(yù)處理的果汁中亞胺硫磷的可能性。旨在為快速分析水果和蔬菜中的亞胺硫磷農(nóng)藥殘留提供了一種可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

匯源100%蘋果汁：購買于上海市浦東新區(qū)古棕路農(nóng)工商超市；

氯金酸(純度99.99%)，檸檬酸三鈉(純度99%)，L-抗壞血酸(純度>99.99%)，亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)品(純度100%)：百靈威科技有限公司；

硝酸銀：純度>99%，美國Sigma-Aldrich公司；

超純水：18.2MΩ·cm，美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

顯微共聚焦拉曼光譜儀：Nicolet DXR型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

場發(fā)射透射電子顯微鏡：JEM-2100F型，日本JEOL公司。

1.3 金核銀殼納米粒子基底制備

1.3.1 金核制備2種尺寸的金納米粒子溶膠 根據(jù)Frens[25]方法修改如下：取0.01%氯金酸溶液100 mL置于250 mL燒瓶中，加熱至沸騰，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液1.8 mL，1 100 r/min劇烈攪拌并保持沸騰5 min，隨后采用冰浴結(jié)束反應(yīng)，即可得到粒徑為(19±2) nm小金核納米溶膠。若加入1%檸檬酸三鈉溶液1.0 mL并保持沸騰15 min，則可得到(43±4) nm大金核納米溶膠。

1.3.2 金核銀殼納米粒子制備 根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]，分別選用上述合成的2種金溶膠作為金種，進(jìn)一步合成Au-Ag NPs溶膠。具體方法如下：將1.2 mL 0.1 mol/LL-抗壞血酸分別加入到0.45，0.90，1.50，3.00 mL金種中，混勻后邊攪拌邊逐滴加入1 mmol/L AgNO3溶液2.7 mL，持續(xù)攪拌5 min后終止反應(yīng)。對應(yīng)于每種金核，分別合成了4種不同銀殼厚度的Au-Ag NPs溶膠，共合成8種Au-Ag NPs溶膠。保存于4 ℃冰箱中待用。

1.4 Au-Ag NPs的透射電鏡圖

利用透射電鏡，對納米粒子的分散性、粒子形狀、核殼結(jié)構(gòu)等進(jìn)行表征，根據(jù)電鏡圖中50個納米粒子的直徑的平均值計(jì)算出粒子的平均粒徑及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取0.010 0 g亞胺硫磷固體粉末，用甲醇溶解，定容至100 mL，配制成濃度為100 mg/L母液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用移液管分別取一定體積的母液，然后用甲醇水溶液(1∶1，體積比)稀釋成濃度為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，5.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.6 樣品溶液的制備

將1 mL 100 mg/L亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液加入至9 mL蘋果汁中，充分搖勻制備成濃度為10 mg/L亞胺硫磷蘋果汁母液，然后取一定量的母液，加入到蘋果汁中，分別配制含有0.05，0.10，0.50，1.00，5.00 mg/L亞胺硫磷的蘋果汁樣品溶液。

1.7 光譜采集

亞胺硫磷常規(guī)拉曼以及SERS圖譜的采集均采用633 nm He-Ne激光源，2 mW激光功率。

1.7.1 常規(guī)拉曼譜圖采集 取少量亞胺硫磷粉末置于載玻片上并擠壓成薄膜，10×顯微鏡物鏡，狹縫寬度50 cm-1，曝光時間5 s，曝光次數(shù)2次。

1.7.2 SERS譜圖采集 將100 μL Au-Ag NPs溶膠與100 μL亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液或蘋果汁樣品溶液充分混合后，移取5 μL混合物，滴于載玻片上，55 ℃下待溶劑至干后，用于SERS分析。采用20×顯微鏡物鏡，狹縫寬度50 cm-1，曝光時間5 s，曝光次數(shù)2次。為提高SERS譜圖的重復(fù)性，每個樣品測試過程中，隨機(jī)在基底上采集10個不同的點(diǎn)獲得10條譜圖，在不同批次合成的基底上重復(fù)采集SERS譜圖2次，共獲得20條譜圖取其平均值進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以拉曼強(qiáng)度(Raman Intensity)為y軸，拉曼位移(Wavenumber)為x軸作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au-Ag NPs的透射電鏡圖

圖1、2為制備的8種Au-Ag NPs的TEM圖，除圖2(d)外，Au-Ag NPs的核殼結(jié)構(gòu)都比較明顯，處于中心位置的一個黑色球形為金核，圍繞中心金核外的較亮的一圈環(huán)狀物可被區(qū)分出來為Ag殼，說明Ag+離子在還原劑抗壞血酸的作用下被還原，沉積到金核表面形成銀殼，得到Au-Ag NPs。隨著金種添加量從3.00 mL降至1.50，0.90，0.45 mL，Au-Ag NPs的直徑逐漸增大。含小Au核[(19±2) nm]的4種Au-Ag NPs(圖1)的平均直徑分別為(35±5)，(42±6)，(59±10)，(91±15) nm，而較大Au核[(43±4) nm]的Au-Ag NPs(圖2)的平均直徑為(66±5)，(78±8)，(91±9)，(127±13) nm。由于在制備Au-Ag雙金屬納米溶膠期間使用的AgNO3溶液的量為固定值，Au膠體的量越少，相同物質(zhì)的量的Ag沉積在越來越少的Au種表面，導(dǎo)致形成的銀殼越來越厚，最終合成的Au-Ag NPs直徑也越大[26]。

2.2 亞胺硫磷常規(guī)拉曼光譜以及Au-Ag NPs的篩選

從圖3可以看出，亞胺硫磷最強(qiáng)的特征峰出現(xiàn)于650 cm-1，主要是由于P=S的變形伸縮振動引起的，其余的主要特征峰分別對應(yīng)于P-O彎曲振動(501 cm-1)，

圖1 Au-Ag NPs金種(19 nm)的透射電鏡圖

圖2 Au-Ag NPs金種(43 nm)的透射電鏡圖

圖3 亞胺硫磷拉曼譜圖

圖4為0.5 mg/L亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS譜圖。這些譜圖中的主要特征峰(510，612，1 015，1 767 cm-1)與亞胺硫磷常規(guī)拉曼譜圖的特征峰(501，605，1 016，1 774 cm-1)基本一致，但有些特征峰的強(qiáng)度和位置發(fā)生了變化。例如，對應(yīng)于常規(guī)拉曼譜圖中650，1 174 cm-1處的特征峰的相對強(qiáng)度大為降低，但在501 cm-1處的特征峰的相對強(qiáng)度得到了極大的增強(qiáng)?？赡苁茿u-Ag NPs與亞胺硫磷分子之間的結(jié)合方式和相互作用等原因所造成的[29-30]。

4種粒徑的小金核(19 nm)Au-Ag NPs對0.5 mg/L亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液均有良好的增強(qiáng)效果，圖中各個主要特征峰均清晰可見，但其SERS增強(qiáng)效果仍有一些差別。從圖4(a)可以看出：納米粒子的直徑由35 nm增加到42 nm，亞胺硫磷的SERS信號增強(qiáng)，但隨著銀殼厚度的繼續(xù)增加，SERS信號反而減弱，表明Au-Ag NPs的銀殼厚度并非越大越好；當(dāng)小金種(19 nm)Au-Ag NPs的尺寸為42 nm時，基底對亞胺硫磷的SERS增強(qiáng)效果最好。圖4(b)為4種粒徑的大金種(43 nm)Au-Ag NPs對0.5 mg/L的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS增強(qiáng)效果由高到低依次為78 nm>66 nm>91 nm>127 nm。因此，選用42 nm Au-Ag NPs(金核19 nm)和78 nm Au-Ag NPs(金核43 nm)作為SERS基底，作為進(jìn)一步分析標(biāo)準(zhǔn)溶液和蘋果汁中亞胺硫磷殘留的SERS基底。

圖4 0.5 mg/L亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜圖

2.3 亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測

圖5為不同濃度的亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜圖，當(dāng)亞胺硫磷濃度為0.05 mg/L時，采用42 nm Au-Ag基底可以觀察到510，612，1 015 cm-1處的特征峰，78 nm Au-Ag 基底可以觀察到對應(yīng)的3個特征峰的強(qiáng)度分別約為前者的12.00，11.25，23.00倍，說明78 nm Au-Ag基底的SERS增強(qiáng)效果更好。

由圖5中可知，隨著濃度的增高，亞胺硫磷的主要SERS特征峰(510，612，1 015 cm-1)的強(qiáng)度也相應(yīng)增大。亞胺硫磷濃度與其SERS特征峰強(qiáng)度之間的線性函數(shù)關(guān)系式及相關(guān)系數(shù)如表1所示，R2在0.767～0.905，其中，在2種基底上所獲得的亞胺硫磷系列濃度SERS圖譜中，位于1 015 cm-1附近的特征峰強(qiáng)度與濃度之間的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為 0.895，0.905，表明該SERS方法有望應(yīng)用于亞胺硫磷的定量分析檢測。

圖5 不同濃度亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS譜圖

Table1LinearrelationshipbetweentheconcentrationofimidanandthecorrespondingintensitiesofeachoftheprimarycharacteristicpeaksintheSERSspectra

2.4 蘋果汁中亞胺硫磷直接檢測

圖6為基于兩種Au-Ag納米粒子未做任何前處理直接檢測蘋果汁中添加的亞胺硫磷的SERS譜圖。以42 nm Au-Ag作為SERS基底時，可以檢測到的亞胺硫磷的濃度為5 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液最低檢測濃度(0.05 mg/L)。而以78 nm Au-Ag納米粒子作為

圖6 不同濃度亞胺硫磷蘋果汁溶液SERS譜圖

SERS基底時，即使在濃度低至0.5 mg/L時，特征峰501 cm-1依然清晰可見，因此78 nm Au-Ag NPs更適宜蘋果汁中亞胺硫磷的直接檢測。值得注意的是，這個蘋果汁中亞胺硫磷的最低檢出濃度仍然是相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出濃度的10倍，說明蘋果汁中基質(zhì)效應(yīng)對SERS檢測的影響極大。

位于730 cm-1附近的峰同時出現(xiàn)在2個基底的蘋果汁的SERS譜圖中(包括空白對照，control)，但在基底(substrate)的SERS譜圖中無此峰，因此730 cm-1是蘋果汁基質(zhì)的特征峰，可能為蘋果汁中的多酚類物質(zhì)引起的[31]。此外，試驗(yàn)結(jié)果表明2種Au-Ag NPs的SERS增強(qiáng)效應(yīng)受到的蘋果汁中非目標(biāo)化合物的影響是不同的，42 nm Au-Ag NPs的SERS增強(qiáng)效果受非目標(biāo)化合物的負(fù)面影響較大，僅能檢測出5 mg/L蘋果汁中的亞胺硫磷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mg/L的檢測濃度，因此必須對蘋果汁溶液進(jìn)行必要的提取和凈化才能達(dá)到滿意的檢出效果。使用78 nm Au-Ag NPs(43 nm Au核)作為SERS基底時蘋果汁中非目標(biāo)化合物的干擾相對較小，可檢測低至0.5 mg/L蘋果汁中的亞胺硫磷，可以用于快速篩選亞胺硫磷超標(biāo)的蘋果汁。

3 結(jié)論

在所合成的8種不同大小的Au-Ag NPs(35～91 nm，金核19 nm；66～127 nm，金核43 nm)中，42 nm Au-Ag NPs(19 nm Au核)和78 nm Au-Ag NPs(43 nm Au核)對于亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS檢測效果最佳，均可檢測到低至0.05 mg/L亞胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。蘋果汁中非目標(biāo)化合物對Au-Ag NPs基底的SERS增強(qiáng)效應(yīng)的影響極大，且對不同基底的影響不同，其中采用42 nm Au-Ag NPs僅能檢測到蘋果汁中濃度為5 mg/L的亞胺硫磷，采用78 nm Au-Ag NPs(43 nm Au核)對低可檢測到蘋果汁中0.5 mg/L亞胺硫磷。本研究表明篩選出合適的粒子尺寸和組成的納米基底對于SERS檢測結(jié)果是非常重要的，同時顯示了應(yīng)用SERS快速分析果蔬中亞胺硫磷農(nóng)藥殘留的可行性。但采用Au-Ag NPs對不經(jīng)樣品預(yù)處理的蘋果汁中亞胺硫磷檢測的靈敏度有待提高，未來研究方向需探明蘋果汁及其它果汁的樣品基質(zhì)對SERS檢測效果的影響及消除方法，以實(shí)現(xiàn)對多種果汁的快速及超靈敏現(xiàn)場檢測。